热消融不全后残存肝癌细胞HepG2生物学特性变化的实验研究*

秦威， 阮镜良， 梁铭， 许晓琳， 田晶， 杨海云， 罗葆明

510120广州,中山大学孙逸仙纪念医院 超声科(秦威， 阮镜良， 梁铭， 许晓琳， 田晶， 杨海云， 罗葆明)



•基础研究•

热消融不全后残存肝癌细胞HepG2生物学特性变化的实验研究*

秦威， 阮镜良， 梁铭， 许晓琳， 田晶， 杨海云， 罗葆明△

510120广州,中山大学孙逸仙纪念医院 超声科(秦威， 阮镜良， 梁铭， 许晓琳， 田晶， 杨海云， 罗葆明)

目的： 探讨热消融不全后残存肝癌细胞HepG2的生物学特性变化。方法：47℃热处理肝癌细胞株HepG2 5min，7.5min，10min，HepG2为正常对照组，倒置光学显微镜下观察热消融不全后残癌细胞的形态变化；(MTS法检测残癌细胞继续培养24h，48h，72h后的OD值，观察其增殖能力；Transwell法检测残留癌细胞迁移能力；残癌细胞进行单细胞培养10 d，观察克隆形成能力。结果：随着热处理时间的延长，发生凋亡的HepG2癌细胞增多；残留癌细胞在24h内的增殖能力增强，随后48h-72h时间段增殖速率降低；迁移能力随热处理时间延长增强，克隆形成能力随热处理时间延长减弱。结论： 热消融不全后残存肝癌细胞HepG2生物学特性发生了变化，在一定时间内增殖速度增快，随后恢复至正常，随着热处理时间的延长其迁移能力增强，但克隆形成能力则下降。

热消融； 肝癌； 复发； 转移

热消融治疗是肝癌非手术治疗的主要手段之一，在临床上已广泛开展。研究表明经热消融治疗的肝癌患者生存率较其他局部治疗方式高[1-2]，但复发率仍然较高[3-4]。消融不全治疗后复发转移成为影响预后及威胁患者生命的主要原因，肿瘤的生物学特性是决定肝癌复发和转移的关键因素， 那么消融不全后肝癌细胞的生物学特性是否发生了改变？本研究拟利用肝癌细胞株HepG2进行热处理不全后对其形态变化，增殖，迁移，克隆形成能力进行研究。

1 材料和方法

1.1 细胞培养及热消融不全处理

肝癌细胞株HepG2细胞购于中山大学动物实验中心，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37℃含5%CO2浓度的培养箱中培养，细胞达80% 融合度时进行传代。将达80% 融合度的HepG2细胞用胰酶消化，进行计数，以8×105接种于25cm2的培养瓶贴壁过夜。更换新鲜培养基后，将细胞置于47℃水浴箱中，处理5min，7.5min，10min(热处理后HepG2细胞简称为HepG2-H)，以未处理的HepG2作为对照组。

1.2 残癌细胞形态学变化

将各组细胞处理后置于倒置光学显微镜下观察细胞的形态学变化及生长变化，选取合适视野进行拍照。

1.3 残癌细胞增殖能力测定

将细胞消化调整细胞浓度至2×104/mL，以200μL细胞接种于96孔板，每组设5个复孔，于37℃、5% CO2 培养箱中培养24h，48h，72h后，每孔加入20μL MTS，继续培养3h，采用MD-SpectraMax M5 多功能酶标仪检测各孔的吸光度，测试时选波长490nm。细胞相对活力计算公式：细胞活力(%)= 实验组细胞吸光度/对照组细胞吸光度×100%。

1.4 残癌细胞迁移能力的检测

将细胞消化离心，用不含FBS的RPMI-1640培养基进行重悬，调整细胞浓度至2×105/mL，以200μL细胞接种于transwell小室内，下室添加600μL含10%FBS的RPMI-1640培养基。继续培养20h后，弃除小室内培养基，用PBS清洗晾干后加入4%多聚甲醛1mL进行固定1h；仍以PBS清洗晾干加入结晶紫染色30min，用棉签擦去上室内未穿过小孔的细胞，显微镜下观察。随机取5个视野进行拍摄计数。

1.5 残癌细胞克隆形成能力检测

将细胞消化离心重悬，调整细胞浓度为150个/mL，每组取2mL接种于6孔板中，置于37℃，5%CO2浓度培养箱中每5d换液一次，连续培养10d。弃细胞上清，用PBS清洗2遍后，加4%多聚甲醛500μL固定1h。然后吸出固定液，加PBS清洗2遍，加入0.1%结晶紫染色30min。移除结晶紫，加PBS清洗2遍，计数各组克隆数。

1.6 统计学方法

各组数据以均数±标准差表示，用方差分析或t检验进行显著性分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 残癌细胞形态学变化

经过47℃温水浴处理后相比，对照组细胞贴壁良好，生长状态及细胞折光性好，伸展充分，而各组HepG2-H生长状况出现明显差异，出现较多漂浮细胞，可见细胞变圆、脱壁，呈凋亡状态。随着热处理时间的延长，凋亡的细胞增多，残存贴壁细胞形态发生变化，细胞触角增多。其中10min组出现大量漂浮细胞，残留贴壁细胞不足5%，考虑到后续实验所需要的细胞量问题，未避免组间差异过大，在后续各实验中选取5min，7.5min组进行热消融不全残癌细胞的增殖、迁移、浸润及克隆形成能力方面的研究(见图1)。

图1 倒置光学显微镜下观察不同处理组细胞的形态学变化(×100)

2.2 残癌细胞增殖能力测定

47℃温水浴处理后HepG2；HepG2-H 5min；HepG2-H 7.5min各组细胞离心种板培养24h，48h，72h后，通过MTS法分别测量其OD值，结果表明：培养24h后HepG2，HepG2-H 5min，HepG2-H 7.5min各组OD值分别为0.72±0.02，0.88±0.02，1.17±0.05(HepG2 vs. HepG2-H 5min vs. HepG2-H 7.5min，t=10.88，P>0.05)；培养48h后各组OD值分别为1.39±0.04，1.59±0.03，1.61±0.05(HepG2 vs. HepG2-H 5min vs. HepG2-H 7.5min，t=7.64，P<0.001)；培养72h后各组OD值分别为2.10±0.02，2.00±0.02，1.89±0.02(HepG2 vs. HepG2-H 5min vs HepG2-H 7.5min，t=7.31，P<0.001)。如图2所示：理论上处理后各组种板的细胞数相同，其起始OD是相同，但经过24h培养后，HepG2-H 5min 与HepG2-H 7.5min的OD值均高于HepG2。 24h至48h时间段显示细胞的增殖速率为HepG2-H 7.5min>HepG2-H 5min>HepG2。从48h到72h的时间段显示HepG2-H 5min， HepG2-H 7.5min的增殖速率较前有所下降，达72h实验终点时各组细胞OD值相近，但经过热处理后细胞的OD值略略低于HepG2组。综上所述，在24h～72h的观察时间段内HepG2组的倍增时间为24h，而HepG2-H 5min， HepG2-H 7.5min增殖速率是先快后慢，起先倍增时间小于24h， 随后的倍增时间延长，大于24h。

2.3 残癌细胞迁移能力的检测

经过20h培养后，对照组HepG2、实验组HepG2-H 5min、HepG2-H 7.5min的迁移值分别为16.0±2.0，52.3±9.3，96.0±8.2， transwell结果表明经过热处理的细胞迁移能力均比未处理组HepG2增强，HepG2-H 7.5min组的迁移能力比HepG2-H 5min强，经过热处理后的两组细胞的迁移能力与对照组相比，具有统计学差异(HepG2-H 5min vs. HepG2 ，t=6.62，P=0.0027；HepG2-H 7.5min vs. HepG2，t=16.44，P<0.001)(见图3、4)。

图2 各组细胞生长曲线比较

图3 各组细胞迁移能力光学显微镜比较

2.4 残癌细胞克隆形成能力检测

HepG2，HepG2-H 5min，HepG2-H 7.5min各组细胞经过10d培养后发现，热处理后各组细胞克隆形成率下降，随着热处理时间的延长，克隆形成能力也随之下降，克隆数分别为68.0±8.4，45.0±11.8，25.0±5.2，与对照组相比，处理组具有统计学差异(HepG2-H 5min vs.HepG2，t=3.29，P=0.030；HepG2-H 7.5min vs.HepG2，t=6.64，P=0.003)(见图5)。

图4 各组细胞迁移能力数量比较

图5 各组细胞克隆形成能力比较

3 讨 论

热消融是通过将电极插入肿瘤组织内，利用射频或微波能量产生60 ℃以上高温，导致肿瘤组织凝固性坏死，从而达到治疗目的的一种物理治疗手段。Portolani等[5]认为消融过程中肿瘤包膜被破坏，同时热能的急剧扩散使局部产生高压，导致将一部分肿瘤细胞推向周边组织，甚至进入到周围的血管或胆管造成复发转移。此外还可能与热消融热场分布不均有关，因为消融时的热场基本呈同心圆分布，电极针所在中心部温度最高，其温度逐渐向周围递减，消融形状呈纵椭圆形或水滴状[6]，但病灶往往呈不规则生长；且活体中的血液循环造成的热沉效应也将对抗消融中的产热效能，因此消融温度的不足导致周边肿瘤残留[7-8]。由于中晚期HCC常呈浸润性生长，瘤体周边往往存在散在、隐蔽着仅在显微镜条件下可见的小转移灶[9]，尽管热消融杀灭了大量的癌细胞，但那些未能被杀灭而受到热刺激的残癌细胞可能出现应激反应来对抗内环境所发生的变化，表现出更强的增殖及侵袭能力[10]，再生的肿瘤更富血供，甚至其分化级别较原来肿瘤细胞低[11]。

本实验研究结果发现经过47℃热处理后残存的细胞增殖速率先快后慢，在48h内均高于HepG2，但达到72h实验终点时各组的细胞OD值却是相近的，甚至处理组的OD值略低于HepG2组。而经过热处理后的残存肿瘤细胞迁移能力较HepG2组增高，随着加热时间的延长，迁移力更强，但其克隆形成能力反而降低。因此我们推测热消融后早期可能残癌细胞受到应激作用导致细胞内部发生了一系列变化引起其增殖能力增强，但这样的应激作用效能并不持久，随后肿瘤细胞又逐渐恢复到先前的增殖速度，而在后续肿瘤的进展中肿瘤细胞迁移能力的增强应该起到更主要的作用，这可能与肿瘤细胞受到热应激后，热休克蛋白的表达时效有关[12]，也有研究者认为可能是与热处理后细胞获得性抗凋亡特性相关[13]。此外肿瘤的微环境对肿瘤生长也起到至关重要的作用，新生血管对残癌的生长提供养分，因此在其进展过程中具有一定的贡献[14]。消融后肿瘤坏死周边区所形成的缺氧区也可能倒逼残癌细胞的恶性特性同时诱导肿瘤干细胞的形成[15-18]。总之，消融后肿瘤发复发转移涉及的具体机制错综复杂，尚不明确，仍有待于我们进一步的研究探讨。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测；

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

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CharacteristicsofResidualHepatocellularCarcinomaCellsFollowingInsufficientThermo-ablationTherapy:AninVitroStudy*

Qin Wei, Ruan Jingliang, Liang Ming, Xu Xiaolin, Tian Jing, Yang Haiyun, Luo Baoming△

(DepartmentofUltrasound,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou, 510120)

Objective: To investigate the characteristics of residual HepG2 cells following insufficient thermo-ablation treatment.Methods: The HepG2 celles were heated to 47℃ for 5min, 7.5min, 10min respectively, and the normal HepG2 cells were control. All cells were observed under microscope and MTS assay was used to determine residual cells proliferation at 24h ,48h and 72h. Transwell assay was used to detect the migration of the residual cells; (4) The ability of clone was observed by cell culture for 10 days.Results: The results showed that with the increasing heating time, the apotosis cells increased. The proliferation of residual cells enhanced within 24h, and decreased in 48-72h group. The ability of migration of residual cells enhanced with the increased heating time. The ability of clone was reduced after heat treatment.Conclusion: The characteristics of residual HepG2 cells were changed after insufficient thermo-ablation treatment. The slope proliferation was enhanced and declined along with the heating time extension. The ability of migration was unregulated, while the ability of clone was reduced.

Thermo-ablation; Hepatocellular carcinoma; Recurrence; Metastasis

2016- 11- 21 [

] 2017- 03- 20

*国家自然科学基金面上项目(编号：81671 704)；广东省自然基金自由申请项目(编号：2016A0303 13306)

△罗葆明,E-mail:43880450@qq.com

R737.9

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.03.003

Qin W, Ruan JL, Liang M, et al. Characteristics of residual hepatocellular carcinoma cells following insufficient thermo-ablation therapy: An in vitro study [J]. J Cancer Control Treat, 2017,30(3):164-167.[ 秦威，阮镜良，梁铭,等. 热消融不全后残存肝癌细胞HepG2生物学特性变化的实验研究[J].肿瘤预防与治疗，2017,30(3):164-167.]