RP-HPLC法测定傣药地不容中延胡索乙素的含量

卯明霞 陆应彩 姜明辉 彭 霞西双版纳州食品药品检验所，云南 景洪 666100



药物研究

RP-HPLC法测定傣药地不容中延胡索乙素的含量

卯明霞 陆应彩 姜明辉 彭 霞*
西双版纳州食品药品检验所，云南 景洪 666100

目的：测定傣药地不容中延胡索乙素的含量。方法：采用RP-HPLC法，色谱柱为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm)；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(39∶ 61)为流动相；流速：1.0mL/min；检测波长：280nm；柱温：30℃。结果：延胡索乙素浓度在10.0299 ～1002.99μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9999；平均加样回收率(n=6)为 100.12 %，RSD=1.75%；样品溶液在24h内稳定，日内精密度良好，RSD=1.42%。结论：所建立的方法经方法学验证，可有效控制地不容的质量。

高效液相色谱法；傣药地不容；延胡索乙素；含量测定

傣药地不容为防己科植物地不容 (山乌龟)StephaniaepigaeaH. S. L.的干燥块根，傣语波波罕。其性凉、苦，入水、风、土塔；具有祛风除湿，清热解毒，止痛之功，用于胃痛，风湿痹痛，咽喉不利，痈肿疮毒[1]。地不容是傣药双姜胃痛丸、健胃止痛胶囊(滇ZJGF/2005-649)、镇静安神胶囊(滇ZJGF/2005-650)处方药材之一，其起镇痛作用的主要活性成分即延胡索乙素。目前，傣药材地不容的标准收载于2005年版《云南省中药材标准》第一册中，但应用HPLC法对其中的延胡索乙素的含量并未见报道。因此，现建立延胡索乙素含量测定方法，为地不容质量控制和质量标准的提升提供参考方法和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent高效液相色谱仪(G4214B-1260DAD；G1316A-1230TCC；G1329-1260ALS；G1311C-1260QuatpumpVL)。

1.2 材料 延胡索乙素对照品(批号：110726-201516，中国药品生物制品检定所)；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。地不容样品采自西双版纳州景洪市、勐海县、勐腊县，经中国科学院西双版纳热带植物园鉴定为防己科植物地不容(山乌龟)StephaniaepigaeaH.S.L。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性考察 色谱柱：Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm)；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠2.0g，磷酸二氢钠8.0g，加水使溶解成1000mL) (38∶62)；流速：1mL/min ；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论板数以延胡索乙素峰计不低于3000。取对照品溶液、供试品溶液、对照品溶液和供试品溶液混合溶液各10μL，按上述色谱条件注入液相色谱仪。色谱图见图1～3。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取延胡索乙素对照品适量，置于100mL量瓶中，用甲醇制成每1mL含100μg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末0.25g，精密称定，置锥形瓶中，精密加浓氨溶液-甲醇(1～20)混合溶液50mL，称定重量，浸泡1h，回流1h，放至室温，再称定重量，用浓氨溶液-甲醇(1∶20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25mL蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取浓度为1002.99μg /mL的对照品储备液适量，加甲醇配制得10.03、25.07、50.15、100.30、300.90、1002.99μg/mL的对照品溶液，摇匀。按上述色谱条件分别进样10μL ，以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归。回归方程为：Y= 8.4172x+ 14.505(r2=0.9999)试验结果表明：延胡索乙素在10.0299～ 1002.99μg的范围内线性关系良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批次的地不容药材(批号：20150712)6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法操作，依次测定，地不容中延胡索乙素的平均含量为3.73%，RSD为1.42%。表明试验的重复性良好。

2.3.3 精密度试验 精密吸取延胡索乙素对照品溶液10μL，重复进样7次，测得峰面积值的RSD为计0.20%。表明仪器的精密性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批次的供试品溶液(批号：20150712)，在0，2，6，12，18，24 h进样测定，测得延胡索乙素峰面积的RSD为0.37%。结果表明供试品溶液在24h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取具塞锥形瓶6个，分别精密加入延胡索乙素对照品5.0491mg(精密称取已知含量的样品(批号：20150712)0.125g，分别加入上述6个具塞锥形瓶中，按“2.2.2”项下方法操作，按上述色谱条件测定，计算回收率。延胡索乙素的平均回收率为100.12%，RSD为1.75%。

2.3.6 样品测定 按照上述色谱条件，分别测定5个不同产地8批样品，计算含量，结果见下表。

表1 不同产地、不同批次的地不容中延胡索乙素的含量 (n=2)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 根据二极管阵列检测器及紫外可见光分光光度计检测得到的光谱图辅助成分定性和选择被测组分检测波长，延胡索乙素确定在282.20、212.70nm处有吸收峰。《中国药典》一部中药材延胡索(元胡)含量测定项下采用280nm作为检测波长，根据延胡索乙素紫外吸收图谱，212.7nm为溶剂末端吸收，因此确定该方法的测定波长为280nm。

3.2 流动相的选择 以乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠2.0g，磷酸二氢钠8.0g，加水使溶解成1000mL) (39∶61)为流动相、乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺调节pH 值至6.0)(40∶60)、乙腈-0.6%冰醋酸溶液(用三乙胺调节pH 值至6.0)(39∶61)等为流动相系统。结果，选择乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠2.0g，磷酸二氢钠8.0g，加水使溶解成1000ml) (39∶61)为流动相，各组分分离好，基线较稳定。

3.3 提取条件的考察 实验考察了氨水-乙醇(1∶20)、氨水-无水乙醇(1∶20)、氨水-甲醇(1∶20)为溶剂，采用回流提取(提取时间为60min、120min、180min)、超声处理(超声时间为30min、45min、60min)。试验结果表明，以氨水-甲醇(1∶20)为溶媒，回流提取60min地不容中延胡索乙素的含量较高，杂质干扰少。

3.4 耐用性试验 按2015年版中国药典新增加了“药品质量标准分析方法验证指导原则”(通则9101)，规范中药质量标准分析方法，为了进一步验证地不容HPLC含量测定方法的可靠性，我们参照该指导原则以地不容的含量测定方法进行了验证。为给本方法用于常规检验提供依据，对其耐用性试验作为进一步探讨，考察了随机变动因素对精密度的影响。考察了不同柱温(25℃、30℃、35℃)、不同色谱柱：依利特 Hypersil ODS2(150×4.6mm, 5.0μm；Agela Technologies Venusil XBP C18(150×4.6mm, 5.0μm)；Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm))、不同检测波长(277nm、280、283nm)、不同流速(0.8mL/min、1mL/min 、1.2 mL/min)。结果基本一致，进一步确保了试验方法的科学性及数据的准确性，为地不容质量标准的提高提供了科学依据。

[1]云南省食品药品监督管理局.云南省中药材标准(第一册)[M].昆明：云南科技出版社，2005： 19.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社2015.

HPLC determination of Tetrahydropaimatine in Stephania epigaea

MAO Mingxia LU Yingcai JIANG Minghui PENG Xia*

Xishuangbanna Institute For Food and Drug Control，Jinhong 666100，China

Objective To establish determine the content of Dai medicine to be tetrahydropalmatine． Methods Methods of the RP-HPLC， Chromatographic column: Agilent C18(150mm×4.6mm，5.0μm), The mobile phase： acetonitrile phosphate buffer (disodium hydrogen phosphate 2.0g, sodium dihydrogen phosphate 8.0g, add water dissolved into 1000mL) (39∶61) as mobile phase.The flow rate was 1 mL/min，and the detection wavelength was set at 280nm, column temperature for 30 degrees． Result The linear range was 10.0299 ～ 1002.99μg (r=0.9999)． the average recovery rate (n=6) was 100.12%,RSD=1.75%．The sample solution is stable within 24 hours, the intra day precision was good,RSD=1.42%．Conclusion This method has strong specificity, good precision and accurate．

HPLC；Stephaniaepigaea；Tetrahydropaimatine；Content Determination

卯明霞(1979-)，女，汉族，学士，主管药师，研究方向为中傣药成分分析及标准研究。E-mail：584578500@qq.com

彭霞(1966-)，女，彝族，学士，主任药师，研究方向为中傣药成分分析及标准研究。E-mail：lisa313@126.com

R284.2

A

1007-8517(2017)12-0009-03

2017-04-20 编辑：梁志庆)