壳聚糖碳材料固定纤维素酶的研究

刘佳+赵再迪+孙溪

摘 要：用共价结合法和交联法将纤维素酶固定在水热制备的壳聚糖碳材料上，并研究其酶活性。结果表明，游离酶、共价结合酶和交联酶的Km值分别是10.92g/L、3.184g/L和0.3132g/L。游离酶和交联酶的最适温度为40℃，共价结合酶为50℃，且共价结合酶的最适反应温度显著拓宽。相比游离酶，两种固定酶都表现出更好的重复使用稳定性和热稳定性，其中共价结合酶最佳。

关键词：纤维素酶；壳聚糖；水热法；固定化

中图分类号：TQ016 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）19-0012-02

前言

纤维素酶是催化纤维素降解成葡萄糖的多酶复合体，化工原料、饲料、燃料、食物和药物等可由葡萄糖发酵得到[1]。游离酶受热易失活，难回收，工业上常将酶固定化利用。壳聚糖由几丁质去乙酰化得到，大量氨基、羟基等电负性基团能与酶结合。但壳聚糖是阳离子聚合物，溶于酸，易被多种非专一性酶降解。目前壳聚糖的改性方法大多通过加入多种化学试剂，不仅对酶有毒害，还使操作复杂化。

水热法模拟自然界的成矿环境[2]，在密闭的反应釜中，以水为溶剂，将常规条件下不易溶解的物质在高温高压条件下溶解并重新结晶，再经过分离得到产物，绿色环保，操作简单。水热法制备的生物质碳材料具有良好的的理化稳定性，相对表面积增大，有大量生物亲和基团，做酶的固定化载体利于酶的结合、底物的扩散[3]。

本文以水热法制备的壳聚糖碳材料为载体，分别通过共价结合法和戊二醛交联法固定纤维素酶，研究酶的米氏常数，最适温度，重复使用稳定性和热稳定性。

1 实验

1.1 材料与仪器

纤维素酶，东京仁成工业株式会社；壳聚糖，>95%；戊二醛，25%；纤维二糖，98%；pH=4.8的HAc/NaAc缓冲液；加热搅拌控制仪；恒温磁力攪拌器；水浴恒温振荡器；高速离心机；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵；Waters超高液相色谱；Bio-Rad傅里叶变换红外光谱仪FTS6000；ASAP 2020 /Tristar3000综合共价结合仪；Elementar元素分析仪Vario EL Cube

1.2 壳聚糖碳材料载体的制备及表征

10g壳聚糖、50mL蒸馏水、磁子放入反应釜后密封，于1000rpm、180℃的加热搅拌控制仪上反应10h，冷却，用无水乙醇和蒸馏水洗至澄清，抽滤，固体烘干备用。将原壳聚糖和该壳聚糖碳材料分别命名为1#CS，2#CS180，对其进行比表面积、红外光谱、元素分析。

1.3 固定纤维素酶

称0.4g2#CS180，加20mL2g/L的酶液，磁力搅拌2h，水洗抽滤，固体即得共价结合酶；称0.4g2#CS180，加20mL7%戊二醛，磁力搅拌3.5h，水洗抽滤，收集固体，加20mL2g/L的酶液，室温下磁力搅拌2h，水洗抽滤，得交联型固载酶。

1.4 酶学性质测定

1.4.1 米氏常数的测定

取5份1mL 2g/L酶液，5份固定酶各0.1g，分别与0.2-1.0g/L底物（纤维二糖HAc/NaAc缓冲液）反应2h，测葡萄糖产量。

1.4.2 反应温度对酶的影响

取6份1mL 2g/L酶液，加3mL 2g/L底物，取0.1g两种固定酶各6份，加3mL0.4g/L底物，30-80℃水浴反应2h，测葡萄糖产量。

1.4.3 固定化酶的重复使用稳定性

固定酶各0.1g，加3mL0.4g/L底物，40℃水浴反应2h，测葡萄糖产量。剩余固体水洗离心3次后，重复以上操作4次。

1.4.4 热稳定性

取5份1mL2g/L游离酶和固定酶0.1g，于70℃水浴保温，隔1h取出一份，加入各自底物，40℃水浴反应2h，测葡萄糖产量。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖材料的表征结果

2.1.1 红外光谱分析

如图1，1# CS和2# CS-180在1635cm-1N-H2特征峰处的峰强基本一致，表明180℃水热反应未对氨基造成损失。

2.1.2 元素分析与比表面积分析

见表1，壳聚糖水热反应后氢含量显著增加，利于结合酶。比表面积增大将暴露出更多的酶的亲和基团，利于酶的结合和底物的扩散。

2.2 酶学性质测定结果

2.2.1 米氏常数

如表2，本实验条件下，固定化纤维素酶的表观米氏常数均低于游离纤维素酶，其中交联酶的Km值最小，为游离酶的2.868%。

固定酶对底物的亲和力更好，是因为壳聚糖所带的正电荷一定程度上使底物更多更快地移向酶的活性中心，促进了底物与酶的有效接触。戊二醛在壳聚糖和酶蛋白之间发生Schiff反应，改变了酶的结构，减小了底物传递的空间位阻[4]。

2.2.2 温度对酶的影响

由图2知，游离酶和交联酶的最适催化温度是40℃，交联酶的酶活力在40℃后直线下降，而共价结合酶是50℃，且在40-60℃间活力都较高。

蛋白质靠疏水效应维持其结构和功能，非水溶性的壳聚糖通过疏水作用与酶的疏水基团聚集能稳定酶的结构。酶的活性可调节和底物专一性要求酶的活性中心具有一定的柔性，当酶固定化后，最适温度的升高能恢复其柔性。反应温度超过40℃后，交联酶迅速失活，说明戊二醛对壳聚糖和纤维素酶的疏水基团造成了破坏。

2.2.3 固定化酶的重复使用稳定性

如图3，交联酶活力低且下降快，共价结合酶的重复使用稳定性较好。这可能是回收利用过程中，频繁的升温降温使酶部分失活，并且多次高速离心使酶与载体的结合越来越松散。

2.2.4 热稳定性

如图4，游离酶保温1h就基本失活，交联酶1h后活力仅剩30%，随着保温时间延长而完全丧失活力，共价结合酶4h后仍有90%以上的活力。游离酶易热变性，当被强耐热性的载体固定化后，热能使活性中心恢复柔性以适应底物，从而减弱热对其结构和功能的破坏。戊二醛交联过程可能破坏了壳聚糖和纤维素酶的结构。

3 结论

壳聚糖碳材料具有良好的理化稳定性，相对表面积大，同时含大量生物亲和基团，适合作载体。用该壳聚糖碳材料固定的纤维素酶米氏常数都减小了，且共价结合酶的最适反应温度比游离酶和交联酶高10℃，热稳定性良好，适合多次使用。

参考文献：

[1]陈实公.固定化纤维素酶的制备及其性质研究[D].合肥工业大学，2006.

[2]张文龙，马儒超，周志伟，等.壳聚糖水热交联炭材料研究[J].江西化工，2014（01）：232-236.

[3]鲁爱华，袁兴中，佟婧怡，等.冻干壳聚糖微球固定化纤维素酶的研究[J].四川环境，2009，28（6）：9-14.

[4]郭锐.固定化纤维素酶的制备及其性质研究[D].天津大学，2009.