SPI shRNA分子探针用于荷瘤裸鼠MR检查的最佳扫描浓度探讨

廖蕤堃，曾丹妮，张竹，张力强，SAGAR Thapa，文明

(重庆医科大学附属第一医院 放射科，重庆 400016)

·论 著·

廖蕤堃，曾丹妮，张竹，张力强，SAGAR Thapa，文明

(重庆医科大学附属第一医院 放射科，重庆 400016)

超顺磁性氧化铁； 分子探针； 磁共振成像； 扫描浓度； 裸鼠

1 材料与方法

1.1 主要材料及设备

探针由课题组制备，并获得国家发明专利授权(专利号：ZL201410064217.6)；SKOV3肿瘤细胞株(中国科学院上海细胞库)；细胞培养基RPMI 1640及胎牛血清(美国GIBCO公司)；0.25%胰蛋白酶(美国HYCLONE公司)；磷酸缓冲液(PBS)；CO2恒温细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)；BALB/c裸鼠，雌性，4～6周龄，体重(22±3)g，购买并饲养于重庆医科大学动物实验中心(省部级共建重点实验室)；戊巴比妥钠(德国Merck公司)；核固红(武汉博士德生物工程有限公司)；亚铁氰化钾[生工生物工程(上海)有限公司]，3.0 T超导型MR成像仪及腕关节线圈(美国GE公司)。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 SKOV3肿瘤细胞株培养及荷瘤裸鼠模型建立

参照课题组既往的成熟方法[3]，将SKOV3卵巢癌细胞株置于含有10%胎牛血清及RPMI 1640培养基内常规(恒温37 ℃、浓度为5%CO2孵箱中)培养，选择对数期生长细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集至10 ml离心管内，以800 r·min-1离心5 min，随后用无血清、无抗生素细胞悬液稀释至细胞浓度为5×107个·ml-1备用。BALB/c裸鼠30只，统一在每只后背部近左侧大腿区域皮下接种SKOV3肿瘤细胞悬液约0.2 ml(含细胞数约为1×107个)，常规饲养，每天定时(人为规定在上午10：00)观察并记录裸鼠精神状态、饮食及肿瘤生长情况，接种后(20±5)d瘤体直径大于1.0 cm，提示荷瘤裸鼠建模成功，可以用于进一步的实验。

1.2.2 探针注射后荷瘤裸鼠活体MR扫描

1.2.2.3 MR扫描参数设置及扫描序列选择 考虑到扫描时间为探针注射后27 h，若注射前至MR扫描结束这段时间内持续麻醉荷瘤裸鼠，可能因为不符合动物的生活状态而影响实验效果，故而选择在注射探针前先行MR扫描作为对照，扫描结束后各组分别注射不同浓度的探针，放回动物实验中心常规分盒饲养，在尾静脉注射探针27 h开始再次MR扫描，两次扫描的部位、参数及序列一致。

在每次MR扫描前均将2%戊巴比妥钠麻醉[剂量为0.1 ml·(20 g)-1]注入荷瘤裸鼠腹腔内，置于自制泡沫板上，医用胶布俯卧位固定，待其呼吸频率降低且呼吸平稳后(目的在于减少呼吸伪影对MR图像的干扰)，置于腕关节线圈内，行MR横断位及冠状位扫描。

在参照文献[7]基础上，经反复预实验并适当调整，最终用于实验的参数如下：(1)T1WI快速自旋回波序列FSE：脉冲序列重复时间/回波时间(TE/TR) 85/300 MinFull, 冠状位FOV 11 cm，横断位FOV 6 cm，激励次数3，层厚 2 mm，间距0.5 mm，矩阵320×224，翻转角20°；(2)T2WI FSE：TE/TR 85/600 ms，FOV 6 cm，激励次数3，层厚2 mm，矩阵320×256，翻转角17°；(3)T2*GRE梯度回波(GRE)：TE/TR 300 ms/MinFull，FOV 6 cm，激励次数3，层厚2 mm，间距 0.5 mm，矩阵320×256，翻转角20°。

1.2.2.4 MR图像采集及分析 采集扫描图像并传输至GE AW 4.6工作站，分别测量最大层面肿瘤及对侧肌肉组织信号强度。为避免误差，人为规定感兴趣区(region of interest ROI)图形为方形游标，面积为20 mm2，测量3次，记录其平均值。

1.2.2.5 病理切片及染色 第2次MR扫描结束后，立即经腹腔注入过量的2%戊巴比妥钠处死裸鼠，取肿瘤组织及荷瘤对侧肌肉组织，以10%缓冲福尔马林液固定，48 h后行石蜡包埋切片，分别行HE及普鲁士蓝染色，光镜下观察。

1.3 统计学处理

计量结果以均数±标准差表示，使用SPSS 18.0软件，浓度组间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 裸鼠模型建立

对数期SKOV3肿瘤细胞经皮下注射后，于实验动物中心统一饲养，30只荷瘤裸鼠生长良好，无一只死亡。在注射(20±5)d，瘤体长径大于1 cm，色泽红润、形态规则(图1)。6、12、18、24、30 mg·kg-1浓度组肿瘤组织体积依次为(1 518.5±605)、(1 641±498)、(1 523±397)、(1 705±580)、(1 400±387)mm3，各浓度组间肿瘤组织体积大小差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 接种肿瘤细胞并饲养18 d

Fig 1 18 d breeding after inoculation

2.2 裸鼠MR成像结果

探针注射前无裸鼠死亡，探针注射后30 mg·kg-1组立即死亡1只，MR扫描结束后24、30 mg·kg-1组各死亡1只(实验过程中均采取保温等相关防护措施，尽量模拟饲养条件)，其余27只裸鼠均存活。

2.2.1 T1WI FSE信号强度变化

不同浓度组的肿瘤组织均出现信号强度改变，与探针注射前比较差异有统计学意义(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1组较6、12 mg·kg-1组差异更显著，而18、24、30 mg·kg-1组间差异无统计学意义；对侧相应区域肌肉组探针注射后信号改变较注射前差异无统计学意义。见表1和图2。

组 织组织信号强度注射前6mg·kg-1组12mg·kg-1组18mg·kg-1组24mg·kg-1组30mg·kg-1组肿 瘤732±35777±29a798±32a843±28a865±33a876±41a对侧肌肉588±31613±24621±44634±21625±29619±26

a 与注射前比较，P<0.05

图2 探针注射后不同浓度组肿瘤组织T1信号变化图像(横断位)

Fig 2 Diagram of signal intensity T1WI FSE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Axial)

2.2.2 T2WI FSE信号强度变化

不同浓度组肿瘤组织于探针注射后均出现信号强度改变，与注射前比较差异有统计学意义(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1组较6、12 mg·kg-1组改变更为明显，18、24、30 mg·kg-1组间差异无统计学意义；对侧相应区域肌肉组织探针注射后信号改变较注射前差异无统计学意义。见表2和图3。

组 织组织信号强度注射前6mg·kg-1组12mg·kg-1组18mg·kg-1组24mg·kg-1组30mg·kg-1组肿 瘤566±40479±31a358±33a247±43b229±39b214±29b对侧肌肉218±22203±12216±18207±19194±21199±17

a 与注射前比较，P<0.05； b 与注射前比较，P<0.001

2.2.3 T2*GRE信号强度变化

不同浓度组肿瘤组织于探针注射后均出现信号强度改变，与注射前比较差异有统计学意义(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1组较6、12 mg·kg-1组改变更为明显，18、24、30 mg·kg-1组间差异无统计学意义；对侧相应区域肌肉组织探针注射后信号改变较注射前差异无统计学意义。肿瘤大致变化趋势与T2WI相似。见表3和图4。

2.3 病理结果

各浓度组的肿瘤组织HE染色结果类似，以24 mg·kg-1组为例，可见肿瘤组织结构紊乱，瘤细胞形态不规则，大小不一致，细胞核异型性较多，部分可见核分裂象改变(图5)；肌肉组织无明显变性、坏死等征象显示。

普鲁士蓝染色结果，探针注射前各浓度组肿瘤组织中未见蓝染颗粒；注射探针后各浓度组均可以见肿瘤组织中存在蓝染颗粒，当探针浓度为18、24、30 mg·kg-1时蓝染颗粒较多(图6)，而对照的肌肉组织中未见蓝染颗粒。

3 讨 论

图3 探针注射后不同浓度组肿瘤组织T2信号变化图像(冠状位)

Fig 3 Diagram of signal intensity T2WI FSE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Coronal)

组 织组织信号强度注射前6mg·kg-1组12mg·kg-1组18mg·kg-1组24mg·kg-1组30mg·kg-1组肿 瘤536±23478±29a355±35a288±15b304±24b299±18b对侧肌肉561±28510±21511±22506±30488±29492±32

a 与注射前比较，P<0.05； b 与注射前比较，P<0.001

图4 探针注射后不同浓度组肿瘤组织T2*GRE信号变化图像(横断位)

Fig 4 Diagram of signal intensity T2*GRE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Axial)

图5 24 mg·kg-1组HE染色结果 ×400

Fig 5 HE straining images(×400)

本课题组前期实验结果及相关文献[2]报道均表明，探针注射24 h后主要富集于活体肝脏、脾脏中，这与共识的网状内皮系统吞噬作用相吻合，同时在MR扫描的T2*GRE序列表现为信号减低。随着探针剂量的加大，肝、脾信号强度呈梯度减低，这些结果为本实验设置浓度梯度提供了依据。分析以上各浓度组扫描图像及信号值，探针注射肿瘤组织均出现信号强度减低，也印证了前期的实验结果。另外，24、30 mg·kg-1组部分裸鼠在探针注射后立即或随后扫描中相继出现死亡现象，我们推测与探针浓度过高有关，即裸鼠无法耐受24 mg·kg-1以上的探针浓度，提示24、30 mg·kg-1不是理想的探针浓度。随后的实验结果也表明，当探针浓度为18 mg·kg-1时，肿瘤组织在T1WI上呈轻度升高，而T2WI及T2*GRE上呈低信号改变，探针浓度在裸鼠耐受范围内且信号强度改变较其余各组明显，能达到肉眼所能分辨程度。因此，活体荷瘤裸鼠MR扫描最佳的探针浓度为18 mg·kg-1。此外，对侧相应区域肌肉组织T1WI、T2WI、T2*GRE信号无明显变化，且与肿瘤组织变化趋势不尽相同，信号差别明显，在图像上能够得到较好的分辨。病理结果也表明，肿瘤组织中蓝染铁颗粒表达较丰富，而肝脏、脾脏中仅存在少量铁颗粒染色，与MR图像观察结果一致。由此可以推断出，本课题组制备的纳米级分子探针(平均粒径为7.37 nm)[12]，能够大部分逃避网状内皮系统的吞噬，易于透过血管及组织间隙，并成功富集于肿瘤组织中，达到了实验的预期目的。

图6 各浓度组普鲁士蓝染色结果 ×400

Fig 6 Prussian blue straining images(×400)

(DepartmentofRadiology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

superparamagnetic iron oxide; molecular probe; magnetic resonance imaging; scanning concentration；nude mice

A