HPLC法测定维格列汀片中的有关物质

黄 姗，张梦泽（1.河南省口岸食品检验检测所，郑州 450003；.河南省食品药品检验所，郑州 450003）

HPLC法测定维格列汀片中的有关物质

黄 姗1＊，张梦泽2（1.河南省口岸食品检验检测所，郑州 450003；2.河南省食品药品检验所，郑州 450003）

目的：建立测定维格列汀片中有关物质的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为XterraMSC18，流动相为[磷酸盐缓冲液-水-乙腈-甲醇（400∶600∶15∶15，V/V/V/V）]-[磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇（400∶450∶150，V/V/V）]（梯度洗脱），流速为1.2m L/m in，检测波长为210 nm，柱温为35℃，进样量为10µL。结果：杂质A、B、C、D检测质量浓度线性范围分别为18.80～188.0µg/m L（r＝0.999 5）、22.64～226.4µg/m L（r＝0.999 6）、21.74～217.4µg/m L（r＝0.999 7）、19.12～191.2µg/m L（r＝0.999 8）；检测限分别为4.18、2.68、1.12、1.34µg/m L；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜3%；加样回收率分别为97.9%～103.1%（RSD＝2.01%，n＝9）、98.8%～104.1%（RSD＝1.93%，n＝9）、98.0%～103.6%（RSD＝1.81%，n＝9）、100.8%～104.1%（RSD＝0.98%，n＝9）。结论：该方法操作简单、结果准确，可用于维格列汀片中有关物质的测定。

维格列汀片；有关物质；高效液相色谱法

维格列汀（Vildagliptin）化学名为1-｛[（3-羟基-l-金刚烷基）氨基]乙酰基｝-2-氰基-（S）-四氢吡咯烷，是一种具有选择性和口服活性的特异性二肽酰肽酶-4（DPP-4）抑制剂[1]，可以刺激胰岛素基因表达和胰岛素生物合成，属于新一代口服降血糖药物[2-4]。目前，我国关于维格列汀有关物质的测定尚未见报道[5]。为更好地控制维格列汀片的质量，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）建立了测定该制剂中有关物质的方法。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括二极管阵列检测器（DAD）、色谱工作站（美国Agilent公司）；XP-205型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-250DV型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率：250W，频率：40 kHz）；M illi-QAdvantageA10型超纯水仪（美国M illipore公司）。

1.2 药品与试剂

维格列汀片（上海太昊生物科技医药有限公司，批号：150701、150702、150703，规格：50mg/片）；维格列汀对照品（上海太昊生物科技医药有限公司，批号：131201，纯度：99.8%）；杂质A对照品（批号：1448-001A2，纯度：97.6%）、杂质B对照品（批号：1607-005A3，纯度：95.7%）、杂质C对照品（批号：1424-093A3，纯度：99.6%）、杂质D对照品（批号：1497-003A7，纯度：98.1%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Xterra MSC18（50mm×4.6mm，3.5µm）；流动相：[磷酸盐缓冲液-水-乙腈-甲醇（400∶600∶15∶15，V/V/V/V）]（A）-[磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇（400∶450∶150，V/V/V）]（B），梯度洗脱（0～1 m in，100%A；2～6 m in，100%→90%A；7～11 m in，90%→30%A；12～21 min，30%A；22min，30%→100%A；23～28m in，100% A）；流速：1.2m L/min；检测波长：210 nm；柱温：35℃；进样量：10µL[6]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取杂质A对照品9.40mg、杂质B对照品11.32mg、杂质C对照品10.87 mg、杂质D对照品9.56mg，置于同一10m L量瓶中，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品细粉适量，精密称定，置于50m L量瓶中，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）适量，超声处理5min使溶解，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得（常温避光保存）。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的处方比例和制备工艺，取不含各待测杂质和主成分的空白辅料适量，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2.4 系统适用性溶液 精密称取维格列汀对照品504.1 mg，置于50 m L量瓶中，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，即得维格列汀对照品贮备液。分别精密称取杂质A、B、C、D对照品适量，置于同一100m L量瓶中，精密加入上述维格列汀对照品贮备液10m L，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）溶解并稀释制成每1m L含维格列汀1mg和杂质A、B、C、D各10µg的系统适用性溶液。

2.3 系统适用性与专属性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液和系统适用性溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度均＞1.5；理论板数以维格列汀峰计为8 700，保留时间为8.96 min。结果表明，其他成分对测定不干扰。

2.4 破坏性试验

2.4.1 酸破坏样品溶液 精密称取样品细粉适量（约相当于维格列汀50mg）（批号：150701），置于50m L量瓶中，加2mol/L盐酸溶液1m L，水浴（37℃）放置1 h，加2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为中性，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）适量，超声处理5 m in使溶解，再加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogramsof system suitability tests

2.4.2 碱破坏样品溶液 精密称取样品细粉适量（约相当于维格列汀50mg）（批号：150701），置于50m L量瓶中，加0.02mol/L氢氧化钠溶液1m L，室温避光放置1 h，加0.02mol/L盐酸溶液调节pH为中性，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）适量，超声处理5m in使溶解，再加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.3 氧化破坏样品溶液 精密称取样品细粉适量（约相当于维格列汀50mg）（批号：150701），置于50m L量瓶中，加30%过氧化氢溶液1m L，水浴（37℃）放置1 h，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）适量，超声处理5 m in使溶解，再加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 高温破坏样品溶液 精密称取样品细粉适量（约相当于维格列汀50mg）（批号：150701），置于50m L量瓶中，于105℃烘箱中避光放置3 h，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）适量，超声处理5m in使溶解，再加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.5 光照破坏样品溶液 精密称取样品细粉适量（约相当于维格列汀50mg）（批号：150701），置于50m L量瓶中，于（12 000±500）lx光照强度下放置24 h，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）适量，超声处理5m in使溶解，再加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

取上述各破坏样品溶液10µL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。由图2可知，样品在酸、碱、氧化、高温、光照破坏条件下均有一定程度的降解，但各降解产物之间及各降解产物与主峰之间均能达到良好分离（分离度＞1.5）。

图2 破坏性试验高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatogramsofdestructive tests

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10m L，分别置于50m L量瓶中，加0.2%盐酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得系列混合对照品溶液。取上述系列混合对照品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测有关物质质量浓度（x，µg/m L）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.6 检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，当信噪比为3∶1时，得检测限。结果，杂质A、B、C、D的检测限分别为4.18、2.68、 1.12、1.34µg/m L。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.7 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，杂质A、B、C、D峰面积的RSD分别为0.98%、0.66%、0.71%、1.02%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：150701）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，杂质A、B、C、D峰面积的RSD分别为2.89%、1.90%、1.66%、0.87%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

取样品（批号：150701）细粉适量（约相当于维格列汀50mg），共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，杂质A、B、C、D峰面积的RSD分别为0.56%、1.26%、0.77%、1.98%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取样品（批号：150701）细粉适量，共9份，分别置于50m L量瓶中，加入低、中、高质量的杂质A、B、C、D对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Resultsof recovery test（n＝9）

续表2Continued tab 2

2.11 样品有关物质测定

取3批样品细粉各适量（约相当于维格列汀50 mg），分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算各待测有关物质的含量[7-8]，结果见表3（注：“-”为未检出）。

表3 样品有关物质测定结果（n＝3，%）Tab 3 Determ ination of related substancesofsamples（n＝3，%）

3 讨论

笔者采用DAD检测器对各待测有关物质进行全波长扫描，结果显示杂质A、B、C、D在200～400波长范围内均仅有末端吸收，辅料在210 nm处基本无吸收，不干扰各待测有关物质范围内的测定，因此最终选择210 nm作为本试验的检测波长。

综上所述，本方法操作简单、结果准确，可用于维格列汀片中有关物质的测定。

[1] IshiiM，Shibata R，Kondo K，etal.Vildagliptin stimulates endothelial cell network formation and ischemia-induced revascularization via an endothelial nitric-oxide synthase-dependentmechanism[J].JBiol Chem，2014，289（39）：27235-27345.

[2] 吕晓川，王伟夫.二肽基肽酶Ⅳ抑制剂治疗2型糖尿病的临床研究进展[J].中国医药导报，2008，5（29）：21-22.

[3] 刘甦苏，吴曦，周舒雅，等.3种小鼠品系的四氧嘧啶糖尿病模型建立及初步评价[J].药物分析杂志，2015，35（11）：1958-1960.

[4] 樊新星，徐珽，卢静，等.抗糖尿病新药维格列汀[J].中国新药杂志，2008，17（14）：1272-1274.

[5] 马廉举，文棘，胡煮，等.反相高效液相色谱法测定维格列汀[J].光谱实验室，2012，29（4）：2555-2558.

[6] Shantikumar S，Satheeshkumar N，Srinivas R.Pharmacokinetic and protein binding profile of peptidom imetic DPP-4 inhibitor-Teneligliptin in rats using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].JChromatogr B，2015（1002）：194-200.

[7] 谢沐风.如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法[J].中国医药工业杂志，2007，38（1）：45-47.

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（编辑：刘 柳）

Determ ination of Related Substances in Vildagliptin Tabletsby HPLC

HUANG Shan1，ZHANG Mengze2（1.Henan Province Port Institute for Food Inspection and Testing，Zhengzhou 450003，China；2.Henan Provincial Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the determination of related substances in Vildagliptin tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Xterra MSC18column w ith mobile phase consisted of[phosphate buffer-water-acetonitrie-methanol（400∶600∶15∶15，V/V/V/V）]-[phosphate buffer-acetonitrile-methanol（400∶450∶150，V/V/V）]（gradient elution）at the flow rate of 1.2m L/min.The detection wavelength was set at 210 nm and column temperature was 35℃. The sample size was 10µL.RESULTS：The linear ranges were 18.80-188.0µg/m L for impurity A（r＝0.999 5），22.64-226.4µg/ m L for impurity B（r＝0.999 6），21.74-217.4µg/m L for impurity C（r＝0.999 7），19.12-191.2µg/m L for impurity D（r＝0.999 8）.The lim its of detection were 4.18，2.68，1.12，1.34µg/m L，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；the recoveries of impurity A，B，C and D were 97.9%-103.1%（RSD＝2.01%，n＝9），98.8%-104.1%（RSD＝1.93%，n＝9），98.0%-103.6%（RSD＝1.81%，n＝9），100.8%-104.1%（RSD＝0.98%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：Themethod is simple and accurate，and can be used for the determ ination of related substances in Vildagliptin tablets.

Vildagliptin tablets；Related substances；HPLC

R927

A

1001-0408（2017）15-2138-04

2016-06-30

2017-01-12）

＊主管药师，硕士。研究方向：食品、药品分析及质量标准。电话：0371-66081055。E-mail：hs13695541@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.34