高效液相色谱法同时分离检测食品添加剂

校 瑞，张晓婷，牛家华，秦培鸽，杨艺欣，卢明华

(河南大学 化学化工学院,河南 开封 475004)



高效液相色谱法同时分离检测食品添加剂

校 瑞，张晓婷，牛家华，秦培鸽，杨艺欣，卢明华*

(河南大学 化学化工学院,河南 开封 475004)

建立了一种同时分离检测没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、二丁基羟基甲苯(BHT)和苯甲酸等食品添加剂的高效液相色谱(HPLC)分析方法. 通过对流动相、流速、柱温、检测波长等色谱条件的优化，确定了最佳的分离检测条件：甲醇(B)和水(A)(0.1%的乙酸溶液)作为流动相，梯度洗脱：0～6 min，60%B，流速0.3 mL/min；6～9 min，60%～100% B，流速0.6 mL/min，柱温维持在25 ℃，检测波长280 nm(PG、TBHQ、BHT)，230 nm(苯甲酸). 在最佳的色谱条件下，方法的线性范围分别为1～200、2～400、2～400、0.5～400 mg/L，检出限(LOD)为0.02～0.06 mg/L，相关系数(R2)均大于0.999 4，加标回收率在77.76%～106.27%之间. 该方法还成功应用于话梅、薯片、方便面实际样品中食品添加剂的分析检测.

高效液相色谱；同时分离检测；食品添加剂；抗氧化剂；防腐剂

抗氧化剂中的丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHQ)是广泛使用的几种人工合成抗氧化剂[1]，它们可以单独使用或与柠檬酸，抗坏血酸等酸性增效剂复合使用，可满足大部分食品制品的需要，但在实际生活中，往往两种或多种抗氧化剂同时使用，这为分离检测工作带来了困难. 这些抗氧化剂具有一定的急性毒性和慢性致癌作用，过量添加会损害人体健康[2-3]，BHA和BHT己在许多国家禁止使用，TBHQ在日本食品中要求不得检出[4-5]. 由于抗氧化剂种类较多，抗氧化的作用机理也不尽相同，比较复杂，存在着多种可能性，归纳起来，主要有以下几种：1)通过抗氧化剂的还原作用，降低食品体系中的氧含量；2)中断氧化过程中的链式反应，阻止氧化过程进一步进行；3)破坏、减弱氧化酶的活性，使其不能催化氧化反应的进行；4)将能催化及引起氧化反应的物质封闭，如络合能催化氧化反应的金属离子等[6-9].

苯甲酸及其盐是最常见的防腐剂之一，广泛应用于制药、化妆品、食品等行业. 以苯甲酸钠作为防腐剂一直引起争议，特别是饮料中的维生素C添加剂与苯甲酸钠相结合时，会产生致癌物苯，对人体造成极大危害[10-12]. GB2760-2014规定，苯甲酸钠最大使用量为1.0 g/kg. 过量添加苯甲酸，还会破坏维生素B1，且使钙形成不溶性物质，影响人体对钙的吸收，同时对胃肠道有刺激性作用，长期使用可诱发荨麻疹、哮喘及血管性水肿等不良反应，对人体健康造成不利的影响[13-14]. 因此，考虑到食品安全问题，苯甲酸的定性和定量的分析就显得尤为重要，在国内外也受到了高度重视.

我们利用高效液相色谱对PG、BHT、TBHQ、苯甲酸这四种物质(图1)进行定性定量分析，并对实际样品中的添加剂含量进行分析检测.

图1 四种目标分析物的结构图Fig.1 Structures of the four analytes

1 实验部分

1.1 仪器

1260高效液相色谱仪(Agilent，美国)，Agilent C18液相色谱柱(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm)安捷伦科技有限公司，塞多利斯电子天平，超声波清洗器(SB-120 DT，宁波新芝)，漩涡混合仪(QL-866，海门市其林贝尔)，pH酸度计(梅特勒-托利多)，台式高速冷冻离心机(TGL-16)，Milli-Q超纯水系统. 微量移液枪(10～00 μL和100～1000 μL，eppendorf)，0.22 μm有机系滤头.

1.2 样品与试剂

PG(98%，阿拉丁)、苯甲酸(99.5%，阿拉丁)、TBHQ(97%，σ)、BHT(≥99%，σ)，冰乙酸(≥99.9%，阿拉丁)，甲醇(一级色谱纯，德国默克)，超纯水. 实际样品话梅、方便面、薯片均购自学校附近亚星超市.

1.3 标准溶液的配制

分别称取PG、苯甲酸、TBHQ、BHT四种目标分析物1.0 mg，用甲醇溶解配成1.0 g/L的储备液，超声混匀. 低浓度的工作溶液由此储备溶液逐级稀释得到.

1.4 样品前处理

分别称取方便面、薯片、话梅(去核)样品各5.0 g于10 mL的离心管中，加入10 mL 甲醇溶剂，漩涡混合10 min，8 000 r/min离心10 min，将上清液转移至50 mL离心管中，再次向残渣加入10 mL甲醇，重复以上操作，合并上清液，在60 ℃条件下氮吹，吹干后再用1 mL甲醇溶解，经0.22 μm滤膜过滤后上机测定.

1.5 HPLC分析

甲醇(B)和水(A)(0.1%的乙酸溶液)作为流动相，梯度洗脱：0～6 min，60%B，流速0.3 mL/min；6～9 min，60%～100% B，流速0.6 mL/min，检测波长280 nm(PG、TBHQ、BHT)，230 nm(苯甲酸)，柱温维持在25 ℃，进样量5 μL.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

通过对有机相比例、流速、柱温等色谱条件的优化，色谱条件为：甲醇(B)和水(A)(0.1%的乙酸溶液)作为流动相，梯度洗脱：0～6 min，60%B，流速0.3 mL/min；6～9 min，60%～100% B，流速0.6 mL/min，检测波长280 nm(PG、TBHQ、BHT)，230 nm(苯甲酸)，柱温维持在25 ℃，进样量5 μL. 在最佳的条件下得到的色谱图如图2所示.

1. 没食子酸丙酯；2. 苯甲酸；3. 特丁基对苯二酚；4. 二丁基羟基甲苯.图2 标准溶液的色谱图Fig.2 Standard chromatograms of the analytes

2.2 标准曲线的绘制

分别配制四种物质0.5、1、5、10、20、50、100、200、400、600、800、1 000 mg/L等一系列浓度的标准工作溶液并绘制其标准工作曲线如图3所示. 表1列出了线性方程、线性范围、检出限(LOD)以及相对标准偏差(RSD). 以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，在最佳的色谱条件下平行测定3次取平均值，得到的相关系数R2≥ 0.999 5. 其中检出限是按照信噪比为3进行测量，得到的检出限在0.37～1.50 mg/L之间，测量5次得到的相对标准偏差小于4.44%，这表明建立的该方法具有较高的灵敏度和很好的重现性.

图3 没食子酸丙酯(a)、苯甲酸(b)、特丁基对苯二酚(c)、二丁基羟基甲苯(d)四种物质的标准曲线Fig.3 Calibration curves for PG (a), benzoic acid (b), TBHQ (c), BHT (d)

化合物线性方程线性范围/(mg/L)R2LOD/(mg/L)RSD/(%,n=5)PGy=44.35x-44.711～2000.99940.754.44苯甲酸y=74.16x+121.800.5～4000.99960.371.26TBHQy=7.40x-14.072～4000.99981.501.30BHTy=3.28x-2.872～4000.99971.502.16

2.3 加标回收率

在线性范围内选取低、中、高3个不同浓度的样品向空白样品中加标，测其加标回收率，平行检测3次取平均值，检测结果表明回收率均大于79.76%，如表2所示.

表2 空白样品的加标回收率Table 2 Recoveries of spiked blank sample

2.4 实际样品的检测

将买来的薯片、方便面、话梅按照1.4进行样品前处理，然后用HPLC检测，三种实际样品与5 mg/L的标准色谱图比对，结果如图4所示.

1. 没食子酸丙酯；2. 苯甲酸；3. 特丁基对苯二酚；4. 二丁基羟基甲苯.图4 话梅(A)、薯片(B)、方便面(C)、5mg/L标准溶液的色谱图(D)Fig.4 Chromatograms of plum (A), potato chips (B), instant noodles (C), 5 mg/L standard solution (D)

将测定结果(峰面积y)带入表1中标准工作曲线求得浓度x，按式(1)计算：

式中：X——试样中标准品的含量(g/kg)；c——测得的峰面积(y)带入标准工作曲线中所求得的浓度(mg/L)；V——提取后样液体积(mL)；m——实际样品质量(g).

检测结果为：话梅中PG的检测含量为0.226 g/kg，苯甲酸的检测含量为2.98 g/kg. 根据《中华人民共和国食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)规定，蜜饯凉果和胶基糖果中苯甲酸最大使用量分别为0.5、1.5 g/kg，因此话梅中苯甲酸的使用量是超标的.

3 结论

建立了一种使用高效液相色谱同时分离检测四种食品添加剂的方法，并对色谱条件进行了优化. 结果表明，该方法的线性关系以及回收率良好，检出限较低，并成功的检测出话梅中PG和苯甲酸的含量，能够达到定量分析的要求. 该方法具有简单、灵敏、快速等优点，对食品中添加剂的定性定量分析具有重要意义.

[2] CALEJA C, BARROS L, ANTONIO A L, et al. Fortification of yogurts with different antioxidant preservatives: A comparative study between natural and synthetic additives [J]. Food Chemistry, 2016, 210: 262-268.

[3] LIDON F, SILVA M M. An overview on applications and side effects of antioxidant food additives [J]. Emirates Journal of Food and Agriculture, 2016, 28(12): 823-832.

[5] DING M Z, ZOU J K. Rapid micropreparation procedure for the gas chromatographic-mass spectrometric determination of BHT, BHA and TBHQ in edible oils [J]. Food Chemistry, 2012, 131(3): 1051-1055.

[6] 姜丽燕. 三类天然抗氧化剂的化学研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2011: 1-2.

JIANG L Y. Chemical studies about three kinds of natural antioxidants [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2011: 1-2.

[7] 张军. 几种酚类抗氧化剂作用机理的理论研究[D]. 济南: 山东师范大学, 2005: 5-7.

ZHANG J. Theoretical research on reaction mechanism of several antioxidants [D]. Jinan: Shandong Normal University, 2005: 5-7.

[8] 黄池宝, 罗宗铭. 食品抗氧化剂的种类及其作用机理[J]. 广东工业大学学报, 2001, 18(3): 77-80.

HUANG C B, LUO Z M. Assortment of food antioxidant and its action mechanism [J]. Journal of Guangdong University of Technology, 2001, 18(3): 77-80.

[9] BORSATO D, De MORAES CINI J R, Da SILVA H C, et al. Oxidation kinetics of biodiesel from soybean mixed with synthetic antioxidants BHA, BHT and TBHQ: determination of activation energy [J]. Fuel Processing Technology, 2014, 127: 111-116.

[10] 聂颖恬. 功能化分子印迹聚合物对食品中三聚氰胺和苯甲酸的检测[D]. 重庆: 西南大学, 2012: 12-13.

NIE Y T. Functional molecular imprinted polymers for the detection of melamine and benzoic acid in food products [D]. Chongqing: Southwest University, 2012: 12-13.

[11] JAVANMARDI F, AREFHOSSEINI S R, ANSARIN M, et al. Optimized dispersive liquid-liquid microextraction method and high performance liquid chromatography with ultraviolet detection for simultaneous determination of sorbic and benzoic acids and evaluation of contamination of these preservatives in iranian foods [J]. Journal of Aoac International, 2015, 98(4): 962-970.

[12] CAKIR R, CAGRI-MEHMETOGLU A. Sorbic and benzoic acid in non-preservative-added food products in Turkey [J]. Food Additives and Contaminants: Part B, 2013, 6(1): 47-54.

[13] 李菊, 刘淑君, 黄雪琳. 苯甲酸和苯甲酸钠安全性与检测方法研究进展[J]. 粮食与油脂, 2012, 9: 49-51.

LI J, LIU S J, HUANG X L. Safety and determination benzoin acid and sodium benzoate [J]. Cereals & Oils, 2012, 9: 49-51.

[14] 王俊红. 食品添加剂苯甲酸检测方法研究进展[J]. 粮食与油脂, 2010, 12: 37-38.

WANG J H. Research progress on detecting methods of benzoic acid in food additive [J]. Cereals & Oils, 2010, 12: 37-38.

[责任编辑：吴文鹏]

Simultaneous separation and determination of food additives by high performance liquid chromatography

XIAO Rui， ZHANG Xiaoting, NIU Jiahua, QIN Peige, YANG Yixin, LU Minghua*

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

A HPLC method for the analysis of food additives including propyl gallate (PG), tert-Butylhydroquinone (TBHQ), butylated hydroxytoluene (BHT) and benzoic acid in foods was developed. The chromatographic conditions with mobile phase, flow rate, column temperature were optimized, and methanol (B) and water with 0.1% acetic acid (A) were used as the mobile phase with that the gradient program is 0-6 min, 60% B, the flow rate of 0.3 mL/min; 6-9 min, 60%-100% B, the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was maintained at 25 ℃. Under the optimized conditions, the linearity range of the method for the analysis of PG, benzoic acid, TBHQ, BHT were 1-200, 2-400, 2-400 and 0.5-400 mg/L with correlation coefficients (R2) with more than 0.999 4. The limits of detection (LODs) were in the range of 0.02-0.06 mg/L at a signal-to-noise ratio of 3, the recoveries of these compounds were in the range of 77.76%-106.27%. The developed method was also applied to analysis real samples.

HPLC; simultaneous separation and determination; food additives; antioxidant; preservative

2016-04-01.

国家自然科学基金(21477033)，河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目(2014GGJS-024)，河南省高校科技创新人才支持计划(17HASTIT003).

校 瑞(1990-)，女，硕士生，主要从事色谱分析方面的研究．*

,E-mail：mhlu@henu.edu.cn.

O65

A

1008-1011(2017)03-0348-05