响应面法优化超声波辅助提取苹果渣低聚糖的工艺

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(山西大学生命科学学院,山西太原 030006)



响应面法优化超声波辅助提取苹果渣低聚糖的工艺

陈文超,张锦华,叶峥,田旭静,张婧婷,范三红*

(山西大学生命科学学院,山西太原 030006)

以苹果渣为原材料,在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken实验设计以及响应面分析法,研究超声时间、料液比、乙醇体积分数和超声温度对苹果渣低聚糖得率的影响。优化后的最佳工艺参数为超声时间35 min、料液比1∶17 (g/mL)、乙醇体积分数80%、超声温度43 ℃,在此实验条件下,苹果渣低聚糖实际得率为13.23%。结果表明,响应面分析法对超声波辅助提取苹果渣低聚糖的工艺优化合理可行,为其开发利用提供了理论支持。

苹果渣,低聚糖,提取,响应面

我国是苹果生产大国,自2004年起一直居全世界鲜苹果出口国第一[1]。2015年,我国苹果资源丰富,种植面积高达232.2公顷,总产值达4100万吨[2],带动了苹果汁加工业的发展,使我国成为最大的苹果汁出口国[3],2015年我国苹果汁出口量为47.5万吨[4],但同时也产生了大量的苹果残渣。从我国目前苹果渣利用情况来看,苹果渣多数以回收垃圾方式处理,少数用作动物饲料[5-6]。苹果渣中含有酚类、糖类、蛋白质、纤维素和维生素等[7-8]。因此,将苹果渣中的有效成分进行提取分离,对减少环境污染,提高废渣利用率有重要意义。

低聚糖又名寡糖,是由2～10个单糖分子由糖苷键聚合而成的低度聚合物[9]。已证实低聚糖具有改善人体内微生态环境、调节肠胃功能、改善血脂代谢、提高人体免疫功能、延缓衰老和抑制肿瘤等显著药理活性[10]。由于低聚糖结构简单、分子量较小,因此溶解性和稳定性好,与多糖相比,活性明显提高且毒性低[11]。获得低聚糖的方式主要有:天然提取[12]、多糖降解[13]、生物法[14-15]、化学或酶法合成[16]等。国内外目前对苹果渣多酚[17-18]、果胶[19]、膳食纤维[20]等功能性成分的研究较为深入,而对苹果渣低聚糖的研究较少,已有研究报道了采用多糖降解[10]的方法提取苹果渣中的功能性低聚糖。天然提取法相比于多糖降解法,具有耗时短、操作方便、工作程序简单、有利于工业化生产的优点,本实验探讨苹果渣低聚糖的天然提取分离技术,采用超声波辅助提取,且对提取工艺条件进行优化,为寻找苹果渣的新利用途径和获得更高的加工附加值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

干燥苹果渣 陕西海升果业发展股份有限公司运城分公司;葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醇 均为分析纯。

RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;SC-3614低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;SHZ-B水浴 恒温振荡器 上海跃进医疗器械厂;HRHS24电热恒温水浴锅 青岛海尔医用低温科技有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;101-2AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;JP-040ST型超声波清洗机 深圳市洁盟清洗设备有限公司;JA1203N型电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司;SP-2000UV型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 苹果渣预处理 去除苹果渣中除了残余果肉及果皮的杂质,用粉碎机粉碎,过80目的筛子,将处理好的苹果渣于-4 ℃保存。

1.2.2 苹果渣低聚糖提取流程 粉碎苹果渣加入乙醇溶液→超声波浸提→4000 r/min、15 min离心分离(去除多糖)[21]→上清液旋转浓缩至原液体积的1/4左右→加4倍体积无水乙醇醇沉24 h(去除多糖及蛋白质)[21]→4000 r/min、15 min离心分离→上清液旋转浓缩至原液体积的1/4左右→ 苹果渣粗低聚糖溶液[22]

1.2.3 单因素实验 在超声波功率为240 W下,分别研究乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间四个因素对苹果渣低聚糖得率的影响。

1.2.3.1 超声时间对苹果渣低聚糖得率的影响 料液比为1∶20 g/mL,乙醇体积分数为80%,超声温度为40 ℃,分别在不同超声时间(8、16、24、32、40 min)下考察苹果渣低聚糖的得率。

1.2.3.2 料液比对苹果渣低聚糖得率的影响 乙醇体积分数为80%,超声时间为32 min,超声温度为40 ℃,分别在不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)下考察苹果渣低聚糖的得率。

1.2.3.3 乙醇体积分数对苹果渣低聚糖得率的影响 料液比为1∶20 g/mL,超声温度为40 ℃,超声时间为32 min,分别在不同乙醇体积分数(35%、50%、65%、80%、95%)下考察苹果渣低聚糖的得率。

1.2.3.4 超声温度对苹果渣低聚糖得率的影响 料液比为1∶20 g/mL,超声时间为32 min,乙醇体积分数为80%,分别在不同超声温度(25、30、40、50、60 ℃)下考察苹果渣低聚糖的得率。

1.2.4 响应曲面实验设计 依据单因素实验的结果,选用料液比、乙醇体积分数、超声温度和超声时间4个因素进行考察,采用Box-Behnken实验设计原理,以低聚糖得率(Y)为指标,优化苹果渣低聚糖提取工艺条件,响应面设计因素与水平如表1所示。

表1 Box-Behnken实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experimental design

1.2.5 苹果渣低聚糖含量的测定 此工艺中提取及醇沉过程中采用较高浓度的乙醇为溶剂,多糖无法溶解在其中,且苹果渣中的单糖含量很低[23],推断此工艺得到的苹果渣提取液中糖类化合物以低聚糖为主,因此低聚糖含量可用总糖含量来表示[24],故采用苯酚-硫酸法[25]测定低聚糖含量。

将葡萄糖在105 ℃下干燥至恒定重量,精密称取25 mg,放置在250 mL容量瓶中,加入适量蒸馏水使之溶解并稀释至刻度,摇匀,得到浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞试管中,分别加水至2 mL。每个试管中精密加入5%苯酚试液1.0 mL,振荡摇匀,迅速加入浓硫酸5.0 mL,振荡充分且摇匀,在40 ℃的水浴锅中保温18 min,取出后迅速降至室温,在490 nm处测定吸光度值。取2 mL蒸馏水,相同的方法操作,作为空白对照。绘制标准曲线,得回归方程:Y=14.431X+0.0047,R2=0.9972。

将提取液稀释取2 mL,加5 mL浓硫酸,1 mL苯酚,根据苯酚-硫酸法于490 nm处测吸光度,计算低聚糖得率。

式中:x为提取液中低聚糖浓度(mg/mL);n为稀释体积;m为苹果渣质量(g)。

1.3数据处理

数据采用Design-Expert 8.0.6软件进行方差分析及显著性检验,采用QriginPro 9.0软件进行图表处理。

2 结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1 超声时间对苹果渣低聚糖得率的影响 超声提取时间对苹果渣低聚糖得率的影响如图1所示。在32 min之内,苹果渣低聚糖得率随着超声提取时间的延长而增加,当超声时间为32 min时,低聚糖得率最高,之后随着超声时间增加低聚糖得率反而减少。这可能是因为超声波作用时间和超声波作用强度存在一定联系,作用时间越长,强度也相应增加,低聚糖的结构受到一定破坏,致使低聚糖得率也减少[24]。

图1 超声提取时间对苹果渣低聚糖得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on the yield of oligosaccharides in apple pomace

图2 料液比对苹果渣低聚糖得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of oligosaccharides in apple pomace

2.1.2 料液比对苹果渣低聚糖得率的影响 料液比对苹果渣低聚糖得率的影响如图2所示。在一定范围内,加大料液比,苹果渣低聚糖得率呈增长趋势,之后得率减小,推测可能由于料液比影响超声波作用于苹果渣的效果,料液比过小,溶液太粘稠,超声波不能充分作用于苹果渣,料液比过大,苹果渣被过量稀释,超声波同样也不能充分作用于苹果渣[26]。因此选择料液比为1∶20(g/mL)。

2.1.3 乙醇体积分数对苹果渣低聚糖得率的影响 乙醇体积分数对苹果渣低聚糖得率的影响如图3所示。随着乙醇体积分数的增大,苹果渣低聚糖得率增加,当乙醇体积分数为80%时,低聚糖得率最大,随之下降。可能因为聚合度较高的苹果渣低聚糖不溶于80%以上的乙醇,低聚糖在乙醇溶剂中含量减少,导致低聚糖得率降低[24]。

图3 乙醇体积分数对苹果渣低聚糖得率的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the yield of oligosaccharides in apple pomace

2.1.4 超声温度对苹果渣低聚糖得率的影响 超声温度对苹果渣低聚糖得率的影响如图4所示。随着超声温度的上升,低聚糖得率逐渐增加,在40 ℃时,低聚糖得率达到最高,随后下降,逐渐趋于平缓,可能由于温度升高使溶剂挥发,溶液粘度随之增加,从而不利于低聚糖溶解,苹果渣低聚糖得率下降[27],因此,超声提取温度选择40 ℃为宜。

图4 超声提取温度对苹果渣低聚糖得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic extraction temperature on the yield of oligosaccharides in apple pomace

2.2响应面优化提取苹果渣低聚糖工艺

2.2.1 Box-Behnken实验设计及结果 在单因素实验结果的基础上,以超声时间(A)、料液比(B)、乙醇体积分数(C)和超声温度(D)为自变量,以苹果渣低聚糖得率(Y)为响应值,利用Design-Expert 8.0.6对苹果渣低聚糖得率进行响应面设计及分析。表2为响应面设计与结果,其中1～20为析因实验,21～25为中心点重复实验。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Design and results of the response surface

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

注:**表示差异极显著(p<0.01);*表示差异显著(p<0.05)。

2.2.2 模型的建立及显著性检验 对表2中的数据利用Design-Expert 8.0.6进行回归分析,得到苹果渣低聚糖得率的二次模型:

Y=13.16+0.40A+0.13B-0.033C+0.86D+0.49AB+0.20AC+0.37AD-0.60BC+0.63BD+0.12CD-0.84A2-0.98B2-1.65C2-2.05D2

对模型进行回归方程系数显著性分析见表3。回归模型极显著(p<0.01),失拟项不显著(p>0.05),说明模型可以拟合实验结果。决定系数R2=95.49%,预测值和实验值具有较好的相关性,说明此模型可以解释95.49%响应值的变化,因此,该回归方程可以描述各因素对苹果渣低聚糖得率的影响,可用以确定苹果渣低聚糖的最佳提取工艺。模型中一次项A、D,二次项A2、B2、C2、D2(p<0.01)影响极显著,交互项AB、BC、BD(p<0.05)影响显著。

2.2.3 响应面分析与优化 根据二次多项回归方程作出响应面图和等高线图,由表3可知,AB、BC、BD交互作用具有显著性,分析双因素交互作用如下。

图5 超声提取时间和料液比交互影响低聚糖得率的响应面图及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of ultrasonic extraction time and solid-liquid ratio on oligosaccharides yield

从响应面曲面的坡度可以看出每个因素对低聚糖得率影响的强弱水平,从等高线图的形状可以看出两个变量间的交互作用是否显著[28]。坡度越大说明该因素对低聚糖得率影响越强,等高线图为椭圆形说明两因素之间交互作用显著。由图可以看出在实验因素水平范围内,存在苹果渣低聚糖的最大得率。由图5可知,超声时间和料液比的交互作用对苹果渣低聚糖得率影响显著,超声时间24～40 min、料液比1∶15～1∶25 g/mL时,低聚糖得率先增大后减小。超声时间32 min、料液比1∶20 g/mL附近值对苹果渣低聚糖得率有重要影响。由图6可以看出,料液比和乙醇体积分数对苹果渣低聚糖得率影响显著,料液比1∶15～1∶25 g/mL、乙醇体积分数65%～95%时,低聚糖得率先增大后减小。料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数80%附近值对苹果渣低聚糖得率有重要影响。由图7可得,料液比和超声温度的交互作用苹果渣低聚糖得率影响显著,料液比1∶15～1∶25 g/mL、提取温度30～50 ℃时,低聚糖得率先增大后减小。料液比1∶20 g/mL、超声温度40 ℃附近值低聚糖得率最大。

图6 料液比和乙醇体积分数交互影响低聚糖得率的响应面图及等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of solid-liquid ratio and ethanol volume fraction on oligosaccharides yield

图7 料液比和超声提取温度交互影响低聚糖得率的响应面图及等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of solid-liquid ratio and ultrasonic extraction temperature on oligosaccharides yield

综合响应面图和等高线图可知,四个因素对苹果渣低聚糖得率的影响及两因素交互作用与回归分析一致。利用Design-Expert 8.0.6分析处理,对拟合的二次回归方程求最大值得到苹果渣低聚糖提取的最佳工艺条件为:超声时间35.01 min、料液比1∶16.67 g/mL、乙醇体积分数79.64%、超声温度42.84 ℃。在此条件下单次提取苹果渣低聚糖,预测值得率为13.3753%。

2.2.4 超声波提取苹果渣低聚糖工艺条件的验证及确定 考虑到实验操作的可行性及方便性,修正最佳提取条件为:超声时间35 min、料液比1∶17 g/mL、乙醇体积分数80%、超声温度43 ℃。按此条件进行三次重复提取实验,苹果渣低聚糖得率分别为13.24%、13.17%、13.29%,计算得平均得率为13.23%,与预测值13.3753%接近,说明该实验模型可以较好地预测超声波提取苹果渣低聚糖的实际提取效果,具有可行性和实际应用价值。

3 结论

本实验在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken实验设计以及响应面分析,对超声波提取苹果渣低聚糖工艺中的主要参数进行分析优化,确定了超声时间和超声温度为显著影响因素,即最佳工艺条件为超声时间35 min、料液比1∶17 g/mL、乙醇体积分数80%、超声温度43 ℃,此条件下低聚糖得率为13.23%。该方法缩短了苹果渣低聚糖提取时间,操作简便易行,为苹果渣资源综合利用率提供了理论支持。

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Optimizationofoligosaccharideextractionwithultrasonic-assistedfromapplepomacebyresponsesurfacemethodology

CHENWen-chao,ZHANGJin-hua,YEZheng,TIANXu-jing,ZHANGJing-ting,FANSan-hong*

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

The apple pomace was used as raw material to extract oligosaccharide by means of ultrasonic-assisted. The effect of ultrasonic time,solid-liquid ratio,ethanol volume fraction and ultrasonic temperature on the yield of oligosaccharides from apple pomace were investigated using Box-Behnken design and response surface methodology,which based on the single factor experiment. The optimal process parameters were as follows:ultrasonic time 35 min,solid-liquid ratio 1∶17 (g/mL),ethanol volume fraction 80%,ultrasonic temperature 43 ℃. Under these conditions,the yield of oligosaccharides from apple pomace was up to 13.23% in practice. The results showed that the method of response surface analysis was reasonable and feasible for ultrasonic extraction of apple pomace oligosaccharides,providing theoretical support for its development and utilization.

apple pomace;oligosaccharide;extraction;response surface methodology

2016-11-23

陈文超(1994-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：164951270@qq.com。

*通讯作者:范三红(1963-)，男，大学本科，教授，研究方向：食品科学，E-mail：fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科学基金项目(2012011031-4)；2016年山西省高等学校教学改革创新项目(J2016003)；2016年山西省研究生教育改革研究课题(2016JG26)。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)12-0277-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.050