复合鱼源乳酸菌抑制哈维氏弧菌协同作用研究

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(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室, 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 2.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083; 3.大连东霖食品股份有限公司,辽宁大连 116101)



复合鱼源乳酸菌抑制哈维氏弧菌协同作用研究

林洋1,孙梦桐1,吕欣然2,马欢欢1,白凤翎1,*,励建荣1,沈琳3

(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室, 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 2.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083; 3.大连东霖食品股份有限公司,辽宁大连 116101)

目的:优化抗哈维氏弧菌鱼源复合乳酸菌的组合。方法:应用牛津杯琼脂扩散法获得无交叉拮抗作用的乳酸菌菌株,利用正交实验优化对哈维氏弧菌具有较强协同抑制作用的乳酸菌组合。结果:获得4株对哈维氏弧菌有抑制效果且无交叉拮抗作用的乳酸菌,优化出菌株清酒乳杆菌YP4-5、清酒乳杆菌YP1-6和植物乳杆菌DY4-2组合以2∶3∶3的比例混合培养,复合发酵液在培养24 h时对哈维氏弧菌的抑菌直径为25.87 mm,分别比YP4-5、YP1-6和DY4-2单菌株的抑菌直径提升27.06%、37.10%和36.73%,表明三株乳酸菌具有协同作用。结论:植物乳杆菌DY4-2、清酒乳杆菌YP4-5和清酒乳杆菌YP1-6具有协同抑制哈维氏弧菌作用,三者以2∶3∶3组合对哈维氏弧菌的抑菌作用较强,可作为水产品养殖过程中控制哈维氏弧菌的乳酸菌复合制剂。

鱼源乳酸菌,复合,协同抑制,哈维氏弧菌

哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)也称哈氏弧菌,是一种具有发光特性的革兰氏阴性细菌,以自由泳动的单细胞形式存在于海洋中,依附在非生物表面[1]。通过释放胞外产物、溶血素、脂多糖、粘附素等多种致病因子引起对虾感染,也可导致大菱鲆、斜带石斑鱼、褐点石斑鱼等海水鱼类和贝类发病,给水产养殖业带来巨大经济损失;还可通过被感染的水产品感染人类,导致人类急性败血症、胃肠炎及坏死性软组织感染等[2-3]。

表1 鱼源乳酸菌的11种不同组合Table 1 The 11 different composes of LAB derived fish

目前主要应用芽孢杆菌、光合细菌和乳酸菌等对水体环境中的哈维氏弧菌污染进行控制[4-6]。其中,应用乳酸菌及其制剂控制水产养殖中污染已取得良好的效果。乳酸菌是肠道正常菌群最主要的有益菌之一,通过产生乳酸、双乙酰、3-苯基乳酸及环(苯丙氨酸-脯氨酸)、环(亮氨酸-脯氨酸)等具有抗菌活性的物质防止外来菌在肠道内定殖,抑制细菌和真菌的生长、维持消化道菌群平衡[7-8]。乳酸菌具有无毒、无残留、无污染等优点,作为生物防腐剂已广泛应用于肉制品、乳制品的防腐保鲜和畜禽养殖业等多个领域[9-10]。Zapata等[11]从罗非鱼肠道分离获得Leuconostocmesenteroides可有效抑制水产养殖环境中VibrioharveyiT34的生长。Talpur等[12]发现来自梭子蟹的Lb.plantarum,Lb.rhamnosus和Lb.salivarius对哈维氏弧菌抑制效果明显。

研究表明将无相互交叉拮抗的乳酸菌菌株进行有机组合,使其形成协同抑菌优势,增强抑菌效果。于佳弘等[13]利用从青贮饲料中获得Lb.plantarum3,P.acidilactici7,Lb.casei9以3∶2∶1比例复合能够优化对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗效果。王菲等[14]研究发现鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌以3∶1∶3比例混合培养能够高效抑制大肠杆菌O157∶H7的生长,抑菌效果明显优于单菌株。Wu等[15]研究发现Lb.plantarum,P.pentosaceus,Lb.mesenteroides,Lb.acidophilus和Lb.brevis等五种乳酸菌复合能够有效抑制咸鱼中致病菌的生长繁殖。目前国内利用复合鱼源性乳酸菌控制水产品中致病菌的研究较少。本文应用海水鱼肠道源性乳酸菌,对抗哈维氏弧菌进行优化组合,为研发水产养殖中控制哈维氏弧菌的高效乳酸菌微生态制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

供试菌株:VibrioharveyiBB170 本实验室保藏;应试菌株：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LP1-4和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DY4-2 分别分离自大菱鲆和刀鱼肠道;清酒乳杆菌(Lactobacillussake)YP4-5和清酒乳杆菌Lactobacillussake)YP1-6 分离自牙鲆肠道,经上海生工生物工程股份有限公司鉴定,本实验室-20 ℃保藏;MRS培养基,LB肉汤,LB营养琼脂 北京奥博星生物技术有限公司。

DL-CJ-2N型超级洁净工作台 东联哈尔(北京)仪器制造有限公司;赛福智能生化培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂;PHSJ-3F实验室pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;GI54DS立式高压蒸汽灭菌锅 致微(厦门)仪器有限公司;IKA Vortex GENIUS 3振荡器 德国IKA公司;MLS-3020高压蒸汽灭菌 日本三洋公司。

1.2实验方法

1.2.1 抗哈维氏弧菌乳酸菌菌株的筛选 从海水鱼肠道中分离的乳酸菌菌株,经MRS液体培养基于37 ℃ 24 h静置培养活化三代,获得菌悬液并稀释至106CFU/mL;取V.harveyiBB170经LB肉汤37 ℃ 24 h静置培养活化三代,稀释菌悬液至106CFU/mL作为指示菌,参照文献[16]利用双层琼脂扩散法进行拮抗性实验筛选拮抗性强的乳酸菌菌株。

1.2.2 抗哈维氏弧菌的乳酸菌交叉拮抗实验 采用交叉拮抗法进行实验,选取一株乳酸菌作为指示菌,其余三株为抑制菌菌株。将106CFU/mL的指示菌菌悬液以2%的接种量接种于MRS琼脂中,参照1.2.1的方法观察是否有抑菌圈出现。

1.2.3 乳酸菌生长与抗哈维氏弧菌活性曲线的测定 取0.2 mL乳酸菌菌悬液接种于10 mL MRS液体培养基中,37 ℃恒温静置培养,每隔4 h取菌株的菌悬液测定其pH,并于600 nm测定其OD值,参照1.2.1测定各个乳酸菌菌株的抑菌活性[17],并对抑菌直径进行显著性分析。

1.2.4 乳酸菌组合对哈维氏弧菌的抑制实验 参照王菲等[14]的方法并稍作修改,将对哈维氏弧菌有明显拮抗效果的乳酸菌进行组合获得11种不同菌株组合(见表1),将各组合中的乳酸菌以同等比例混合在MRS液体培养基中进行活化,取24 h培养物稀释至106CFU/mL,参照1.2.1的方法37 ℃静置培养24、48、72 h,测量抑菌直径。

1.2.5 乳酸菌组合抑制哈维氏弧菌的优化实验 对1.2.4实验得到的对哈维氏弧菌具有最佳拮抗效果的组合进行正交实验,设计三因素三水平表,如表2所示。利用正交实验设计获得不同比例的乳酸菌组合,参照1.2.1的方法37 ℃静置培养24、48、72 h,测量抑菌直径。

表2 三因素三水平正交表Table 2 The orthogonal table of three factors and three levels

1.2.6 乳酸菌组合生长与抗哈维氏弧菌活性曲线 取0.2 mL按最佳配比混合后的乳酸菌菌悬液接种于10 mL MRS液体培养基中,于37 ℃下恒温、静置培养,每隔4 h取菌株的菌悬液测定其pH,并于600 nm测定其OD值,参照1.2.1测定组合菌株的抑菌活性。

图3 乳酸菌生长和抗哈维氏菌活性曲线Fig.3 The growth of LAB and antagonistic activity curve on V. harveyi注:不同字母表示抑菌直径具有显著差异(p<0.05)。

1.2.7 数据处理 利用软件Origin 8.0进行实验数据处理,数据平行3次,结果用平均值±标准偏差表示,采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。

2 结果与讨论

2.1拮抗性乳酸菌的筛选

图1是乳酸菌菌悬液对哈维氏弧菌的抑菌效果图,从中可以看出菌悬液对哈维氏弧菌有显著抑制作用。植物乳杆菌LP1-4、植物乳杆菌DY4-2、清酒乳杆菌YP1-6和清酒乳杆菌YP4-5菌悬液对哈维氏弧菌的抑菌直径分别为17.39、18.92、18.87 mm和20.36 mm。

图1 乳酸菌菌悬液对哈维氏弧菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effects of cell suspension produced by LAB against V. harveyi

2.2抗哈维氏弧菌乳酸菌的交叉拮抗实验

将4株乳酸菌进行交叉拮抗实验,图2是4株乳酸菌之间的拮抗效果图,从中可以看出4株乳酸菌之间均不存在明显相互作用。因此选择菌株植物乳杆菌LP1-4、植物乳杆菌DY4-2、清酒乳杆菌YP1-6、清酒乳杆菌YP4-5作为后续研究菌株。

图2 乳酸菌菌株交叉拮抗效果图Fig.2 Effect picture of LAB cross antagonism

2.3乳酸菌生长与拮抗哈维氏弧菌活性曲线

图3是植物乳杆菌LP1-4、植物乳杆菌DY4-2、清酒乳杆菌YP1-6和清酒乳杆菌YP4-5菌悬液经37 ℃静置培养40 h的pH、生长曲线及对哈维氏弧菌的抑菌活性的动态变化情况,从图3中可得出,4株乳酸菌菌株对哈维氏弧菌抑菌活性与细胞生长量两者之间呈现同步增长趋势,但在稳定期呈平稳状态。随着抑菌活性与细胞生长量的增加,pH呈现迅速下降在20 h左右逐步趋于平稳。结果表明,到达稳定期后,其次级代谢产物保持较高抗菌活性且对哈维氏弧菌的最大抑菌作用为培养24 h的菌悬液。

2.4抗哈维氏弧菌复合乳酸菌抑菌实验

表3是对哈维氏弧菌具有明显抑制效果的4株乳酸菌:LP1-4、DY4-2、YP1-6、YP4-5以所有不同组合方式复合后对哈维氏弧菌的抑菌直径,从表中可以看出11种不同组合中,第8组(YP4-5、YP1-6、DY4-2)对哈维氏弧菌产生了最佳的抑菌效果。

表4 不同配比的乳酸菌组合对哈维氏弧菌的抑制效果(mm)Table 4 Antibacterial effect of the different proportions of LAB on V. harveyi(mm)

表5 验证实验结果Table 5 The result of verifying tests

表3 乳酸菌组合对哈维抑菌的抑菌效果(mm)Table 3 Antibacterial effect of the different composes of LAB on V. harveyi(mm)

注:同列不同字母表示显著差异(p<0.05)，表3～表5同。

2.5抗哈维氏弧菌乳酸菌组合优化实验

表4是对具有最佳抑菌效果的由YP4-5、YP1-6、DY4-2三株菌组合成的复合乳酸菌,采用L9(34)正交实验优化不同配比对哈维氏弧菌的抑制效果。从表4中可以看出,在9组不同配比的复合乳酸菌中,第6组A2B3C1组合时,对哈维氏弧菌的抑菌效果达到最佳;而由k值可得,A2B3C3对哈维氏弧菌的抑菌效果最好。表5为验证实验结果,从表中可以看出A2B3C3的抑菌效果较优,但两组差异不显著。综上,植物乳杆菌DY4-2、清酒乳杆菌YP4-5和清酒乳杆菌YP1-6的最佳添加量分别为2×106、3×106、3×106CFU/mL,即三者的最佳比例为2∶3∶3。

2.6复合乳酸菌生长与抗哈维氏弧菌活性曲线

图4是复合菌株对哈维氏弧菌的pH、生长曲线及对哈维氏弧菌的抑菌效果的动态变化情况,由图可知,复合菌株对哈维氏弧菌抑菌活性与细胞生长量两者之间呈现同步增长的趋势,但在24 h后呈平稳状态。随着抑菌活性与细胞生长量的增加,pH呈现迅速下降在20 h后逐步趋于平稳,表明4株乳酸菌在4～8h内处于对数增长期,达到稳定期后其次级代谢产物达到较高水平。植物乳杆菌DY4-2和清酒乳杆菌YP4-5、清酒乳杆菌YP1-6组合成的复合乳酸菌产生的抑菌效果大于单株乳酸菌的抑菌效果,抑菌直径最高达25.87 mm,分别比清酒乳杆菌YP4-5、清酒乳杆菌YP1-6和植物乳杆菌DY4-2的抑菌直径高出了27.06%、37.10%和36.73%。

图4 复合乳酸菌生长和抗哈维氏弧菌活性曲线Fig.4 The growth of complex LAB and antagonistic activity curve on V. harveyi

3 结论

通过对来自大菱鲆、刀鱼和牙鲆等海鱼肠道的乳酸菌进行优化组合,筛选出抗哈维氏弧菌的植物乳杆菌DY4-2、清酒乳杆菌YP4-5和清酒乳杆菌YP1-6以2∶3∶3比例组合时,抑菌直径达到25.87 mm,该复合乳酸菌的抑菌效果显著高于单一菌株抑菌效果。结果表明,通过相互间无拮抗作用的乳酸菌进行抗菌效应叠加,以实现高效生物防腐作用,为进一步应用乳酸菌研发微生态制剂控制海水养殖中致病菌具有一定的应用价值。

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SynergyinhibitioneffectofcomplexlacticacidbacteriaderivedfishonVibrioharveyi

LINYang1,SUNMeng-tong1,LVXin-ran2,MAHuan-huan1,BAIFeng-ling1,*,LIJian-rong1,SHENLin3

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province, National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China; 2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China; 3.Dalian Donglin Food Co.,Ltd.,Dalian 116101,China)

Objective:The aims of this study were to optimize an efficient combination of lactic acid bacteria(LAB)with strong antagonistic activity againstVibrioharveyifrom the marine fish intestine. Methods:LAB with no cross antagonism were obtained using the method of Oxford cup agar diffusion. Complex LAB with strong synergy inhibition activity againstV.harveyiwas optimized by orthogonal experiment. Results:Lactic acid bacteria were obtained from the marine fish intestine,which had strong inhibition activity againstV.harveyiand had no cross antagonism. The bacterial suspension of strain YP4-5,YP1-6 and DY4-2 combined with the ratio of 2∶3∶3 reached the maximum zone of inhibitory diameter and reached 25.87 mm at 24 h,which increased 27.06%,37.10% and 36.73% than that strain YP4-5,YP1-6,DY4-2 respectively. It indicated that the three strains LAB had the synergetic effects. Conclusion:Lb.plantarumDY4-2 andLb.sakeYP4-5,Lb.sakeYP1-6 had synergetic effects. againstV.harveyi,which combined with the ratio of 2∶3∶3 had strong antagonistic activity againstV.harveyi. Therefore,the complex LAB can be used as the composite microbial agent for the control ofV.harveyiin aquaculture.

lactic acid bacteria derived fish;complex;synergy inhibition;Vibrioharveyi

2016-11-28

林洋(1994-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制，E-mail：linyang19940109@163.com。

*通讯作者:白凤翎(1964-)男，博士，教授，研究方向：食品安全与质量控制和食品微生物学，E-mail：baifling@163.com。

泰山学者蓝色产业领军人才团队支撑计划项目(鲁政办字(2015)19号)；“十二五”国家科技支撑计划课题(2015BAD17B05)。

TS254.4

:A

:1002-0306(2017)12-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.036