响应面法优化灵芝孢子粉中灵芝酸的破壁提取工艺

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(长春科技学院生物食品学院,吉林长春 130000)



响应面法优化灵芝孢子粉中灵芝酸的破壁提取工艺

冯印,刘乔,李岩,刘艳,沈明浩*

(长春科技学院生物食品学院,吉林长春 130000)

目的:以超声提取法为主,漆酶破壁法为辅助提取灵芝孢子粉中的灵芝酸,对影响提取得率的几个因素进行优化。方法:借助Design-Expert软件,利用Placket-Burman实验从超声时间、超声次数、溶剂、料液比、酶量、酶解时间、酶解温度和pH这8个影响提取得率的因素中筛选出四个主要因素,分别为超声时间、超声次数、溶剂和酶解时间,在此基础上,用Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析。结果:当超声时间为3.2 h,溶剂用97%的乙醇,超声次数2次,酶解时间1.2 h时,提取得率达到最高,为3.40%,与初始提取得率2.4%相比,提取得率提高了1.4倍。结论:采用漆酶破壁与超声提取方法较大幅度提高灵芝酸的提取得率,并缩短了提取时间。

漆酶,灵芝孢子粉,灵芝酸

灵芝,又称“灵芝草”、“仙草”、“瑞草”,为担子菌纲多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝(G.lucidum)和紫芝(G.japonicum)的总称[1],灵芝主要成分为多糖类和三萜类。自1982年KUBOTA[2]首次从灵芝(G.lucidum)子实体中分离得到三萜类化合物灵芝酸A和灵芝酸B后,各国都展开了对灵芝三萜类化合物的研究,三萜类成分复杂,曾祥丽等[3]报道灵芝含有122种三萜类成分,其中最主要是灵芝酸37种,林志彬等研究认为灵芝三萜具有抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、保肝、抗肿瘤和抗艾滋病毒等药理活性[4-9],灵芝三萜类物质(Ganoderma lucidum,Triterpenoid)对特异性细胞免疫也具有增强作用,可显著增强小鼠体液免疫功能,并对非特异性免疫也具有调节作用[10]。

灵芝孢子具有坚硬的双层外壁结构,其成分几丁质含量为52.08%～57.64%,无机元素构成以Si(19.01%)、Ca(24.31%)为主,硅和钙掺入几丁质使得孢壁更加结实坚硬,且耐酸碱,极难氧化分解[11],因此未破壁的灵芝孢子不易于提取其中的有效物质,朱江[12]等人采用复合酶酶解方法生产破壁灵芝孢子粉,本文采用漆酶酶解及超声波技术结合的方法从未破壁的灵芝孢子粉中提取灵芝酸,并利用响应面实验将工艺优化,工艺操作简单且提取得率高。漆酶可以酶解灵芝孢子的坚硬的外壁,超声波技术也可以利用其强烈的振动和空化效应辅助灵芝孢子中的灵芝酸提取出来,将两者结合起来并做一个优化实验,有效提高了灵芝酸的提取得率,缩短了提取时间,且成本低。这种方法可为灵芝酸的工业生产提供有利的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料和仪器

漆酶(4000 U/g) 购于Sigma公司;灵芝孢子粉 购于吉林市丰茂山珍特产店;无水乙醇、柠檬酸、磷酸二氢钠、CHCl3、NaHCO3、齐墩果酸、香草醛冰醋酸 均为国产分析纯。

KQ-250B超声波清洗器 东京理化器械株式会社;DZF-6050真空干燥箱 上海光谱仪器有限公司;N-1001D-WA旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社;722可见分光光度计 上海光学仪器一厂。

1.2实验方法

1.2.1 灵芝酸的提取 称取一定质量灵芝孢子粉,加入适量漆酶和pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,在70 ℃下破壁1 h,100 ℃灭酶10 min、真空干燥去掉缓冲液,加入98%的乙醇为溶剂超声提取,超声功率200 W,抽滤得滤液45 ℃减压浓缩得棕黄色固油混合物,混合物复溶于100 mL的CHCl3中,用饱和NaHCO3溶液CHCl3/NaHCO3(体积比为1∶1)萃取3次,取NaHCO3溶层,用6 mol/L盐酸酸化至pH 3～5后用等量CHCl3再萃取3次,合并CHCl3层,减压浓缩干燥得黄色粗灵芝酸组分(GA)[13]。

1.2.2 优化实验

1.2.2.1 单因素实验 采用单因素实验,分别考察超声时间、超声次数、溶剂、料液比、酶解时间、酶解温度、pH和加酶量8个因素,分别得最优值为超声时间3 h、超声次数2次、溶剂为95%的乙醇、料液比1∶60、酶解时间1 h、酶解温度70 ℃、pH6.0、加酶量2.0%(w/v)。

1.2.2.2 PB实验设计 以测量样液的吸光值为指标,在单因素的基础上,选取影响结果的因素包括超声时间、超声次数、溶剂、料液比、酶量、酶解时间、酶解pH、酶解温度8个因素,进行n=12的Placket Burman因子筛选实验,8个因素分别对应表中的8个列,每个因素取低水平“-1”和高水平“1”,以测量的A值为响应值对实验结果进行分析,得出各因素的F值和可信度水平。Placket-Burman因素水平表见表1。

表1 PB实验因素水平表Table 1 Factors and levels table in PB experiment

表2 Box-Behnken实验设计因素与水平表Table 2 Factors and levels table of Box-Behnken experimental design

1.2.2.3 响应面设计确定显著因子的最佳值 利用软件Design-Expert,对表2超声时间、溶剂浓度、超声次数、酶解时间,四个因素进行三水平的29个响应面实验,各因素水平设计见表2。

1.2.3 标准曲线的制定及灵芝酸含量计算

1.2.3.1 标准曲线的制定 精确称取0.0093 g齐墩果酸(标准品)于50 mL容量瓶中用无水乙醇定容,制成0.0186 mg/mL浓度的标准溶液,分别取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的样液于具塞试管中80 ℃水浴挥干,分别加入新配制的5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸1.2 mL后70 ℃水浴保温反应15 min,流水冷却至室温,分别加入3.6 mL的乙酸乙酯,振荡后静置15 min,550 nm波长下用紫外可见分光光度计测其吸光度[14-15]。以齐墩果酸浓度为横坐标,测得的吸光度为纵坐标绘制成标准曲线,得出线性方程为A=47.377X+0.0035(R2=0.9989),表明齐墩果酸在该浓度范围内呈现良好的线性关系。

1.2.3.2 灵芝酸提取得率计算 将提取出的粗灵芝酸组分用无水乙醇定容至10 mL,精确吸取一定体积的样液于具塞试管中作为反应样液,参照1.2.3.1中标准曲线中的操作方法进行反应并测定吸光值,灵芝酸提取得率Y计算公式为:

Y=X×V×N/M×100=(A-0.0035)/47.377×V×N/M×100

式中:Y:灵芝酸提取得率(%);A:吸光值;X:反应样品浓度(mg/mL);V:反应体系的体积(5 mL);N:定容的体积与反应样液之比(100);M:称取孢子粉质量(mg)。

1.3数据处理

采用Design-Expert软件(Version 7.0 Stat-EaseInc.,Minneapolis,MN,USA)对响应面实验得到的数据进行线性回归和方差分析,模型及因素的显著性均通过F值考察(p<0.05),所有实验均做3个重复。

2 结果与分析

2.1 PB实验

Plackett-Burman实验设计筛选影响因子结果见表3,因素水平及效应分析见表4。

表3 Placket-Burman实验设计及响应值(n=12)Table 3 Placket-Burman experiment design and response values(n=12)

表4 Placket-Burman实验设计的因素水平及效应分析Table 4 Placket-Burman factor levels of experimental design and effect analysis

注:*差异显著(p<0.05);**差异极显著(p<0.01);表6同。 从表4中的主效应分析可知,Placket-Burman的二水平范围内,超声次数、溶剂浓度、酶解时间、超声时间影响极显著,影响响应值的因素顺序依次为超声次数、溶剂浓度、酶解时间、超声时间。经影响因素筛选,得到以吸光值为响应值的线性回归方程Y=0.93+0.056X1+3.167X5-003X2+0.065X3+0.070X4-0.027X5-0.016X6+0.016X7+0.058X8

方差分析模型Prob(P)=0.0009,表明所得回归方程达到极显著,即该模型在整个被研究的回归区域拟合很好,复相关系数R2=0.9111,说明相关性较好,本实验精密度达到15.092。

2.2二次回归模型拟合及方差分析

采用Box-Behnken的中心原理进行实验,以吸光值作为响应值。以超声次数、溶剂浓度、酶解时间、超声时间四因素作为自变量,结果如表5所示。

表5 Box-Behnken实验设计和实验结果Table 5 Box-Behnken experiment design and results

续表

表6 Box-Behnken ANOVA分析结果Table 6 Box-Behnken ANOVA analysis results

通过Design-Expert 统计软件对实验数据进行二次响应面回归分析,以吸光度A值为因变量(Y),超声时间(A)、溶剂浓度(B)、超声次数(C)和酶解时间(D)为自变量建立二次回归方程为Y=1.49+0.095A+0.095B+0.19C+0.12D-5.000E-004AB-2.750E-003AC+0.062AD+0.072 BC+0.060BD+0.085CD-0.26A2-0.19B2-0.28C2-0.28D2

用响应面分析软件Design-Expert 7.0对表5的数据进行多元回归拟合,实验数据拟合分析(analysis of variance,ANOVA)结果见表6。

2.3两因素交互作用响应面分析

响应面分析图见图1,响应面可以直接反映出各因子对响应值的影响大小,由图可知,AD、BC、CD的等高线形状近乎于椭圆形,且变化稀疏,说明AD、BC、CD即超声时间和酶解时间、溶剂和超声次数、超声次数和酶解时间的二者之间交互作用显著,且这几个因素的值对影响值峰值影响较大。根据实验结果和方差分析,响应面分析得出一个最优方案,即超声时间3.22 h,溶剂乙醇浓度96.90%,超声次数2.44次,酶解时间1.17 h;考虑到实际操作条件等情况,将最优值调整为超声时间3.2 h,溶剂用97%的乙醇,超声次数2次,酶解时间1.2 h,在此条件下做三次验证实验得吸光值平均值为1.612,与理论预测值1.580接近,根据1.2.3.2中公式计算灵芝酸提取得率为3.40%,与初始提取得率2.4%相比,提取得率提高了1.4倍。预测主次因素依次为超声次数>酶解时间>超声时间>溶剂浓度。

图1 各因素交互影响的响应面图Fig.1 Response surface graphs of factors interaction

3 结论

在前期单因素实验的基础上,利用PB实验从八个影响因子之间筛选四个重要因子,再应用BBD实验对这四个重要因素进行优化,建立了这四个因子之间的二次回归模型,获得应用漆酶和超声波技术提取灵芝孢子粉中的灵芝酸的最佳工艺,即超声3.2 h,溶剂用97%的乙醇,超声次数2次,酶解时间1.2 h,在此条件下做三次验证实验得吸光值平均值为1.612,与理论预测值1.580接近,根据1.2.3.2中公式计算灵芝酸提取得率为3.40%。有效提高了灵芝酸的提取得率,缩短了提取时间。

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Optimizationofwall-breakingextractiontechnologyofGanodericacidfromGanodermaSpores(GS)usingresponsesurfacemethodology

FENGYin,LIUQiao,LIYan,LIUYan,SHENMing-hao*

(College of Biological and Food,Changchun Science and Technology University,Changchun 130000,China)

Objective:Ganoderma Spores(GS)was used as raw material as the ultrasonic extraction as the main method and laccase wall-breaking method the secondary one to extract Ganoderic acid,the extraction factors affected the extraction ratio were optimized. Methods:Ultrasonic time,ultrasonic frequency,solvent and enzymolysis time were identified as the main factors from asonic time,ultrasonic frequency,solvent,solid-liquid ratio,enzyme amount,enzymolysis time,digestion temperature and pH which influenced the extraction ratio using experimental design of Placket-Burman(PB)by design-expert software. On this basis,the experimental design of Box - Behnken(BBD)and response surface analysis method was used for regression analysis. Results:When the ultrasonic time was 3.2 h,the solvent was 97% ethanol,ultrasonic frequency of 2 times,enzymolysis time for 1.2 h,reached the highest extraction rate was 3.40%,and the extraction yield increased 1.4 times compared with the initial design. The extraction rate of ganoderma lucidum acid was increased greatly and the extraction time was shorten by the combined ues of cell wall disruption with lasscase and ultrasonic extraction.

laccase;GS;Ganoderic acid

2016-12-12

冯印(1986-)，女，硕士，研究方向：食品微生物与功能性食品，E-mail：113889523@qq.com。

*通讯作者:沈明浩(1963-)，男，博士，教授，研究方向：食品毒理与安全，胚胎毒理，E-mail：shenmh2003@163.com。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)12-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.035