系统性红斑狼疮患者中miR-410表达及其靶基因生物信息学分析①

张 济 欧大明 黄丽芳 欧阳琳 邹礼衡

(南华大学附属第一医院风湿免疫科，衡阳421001)

·临床免疫学·

系统性红斑狼疮患者中miR-410表达及其靶基因生物信息学分析①

张 济 欧大明 黄丽芳 欧阳琳 邹礼衡

(南华大学附属第一医院风湿免疫科，衡阳421001)

目的：检测miR-410在系统性红斑狼疮患者(SLE)中的表达水平，运用生物信息学方法研究miR-410及其靶基因在SLE发生发展过程中的作用。方法：定量检测miR-410在SLE患者外周血单个核细胞中的表达水平，并通过miR-410序列分析，靶基因预测和Genecards数据库分析，进一步对其靶基因进行GO富集和KEGG Pathway分析。结果：miR-410在SLE患者中表达显著降低，其核苷酸序列在多物种间呈高度保守性。受miR-410调控且与SLE疾病相关的潜在靶基因包括FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等。GO分析发现miR-410的靶基因参与细胞生长增殖、程序性死亡、细胞分化、免疫系统发育等多个生物过程。KEGG Pathway分析发现miR-410的靶基因显著富集在肿瘤途径信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、胶质瘤信号通路、黑色素瘤信号通路、TGF-β和JAK-STAT 信号通路等。结论：miR-410可能通过直接靶向作用其调控靶分子，影响SLE患者体内多条信号通路的网络调控，从而参与SLE疾病的发生和发展。

miR-410；SLE；靶基因；GO富集；KEGG信号通路

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多发于青年女性的累及多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，由于免疫细胞过度增生激活，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位，导致皮肤黏膜、骨骼肌肉、心脏、肾脏及神经系统等多个组织器官损伤。microRNA(miR)是一类由18～25核苷酸(nt)组成的小分子单链非编码小调控RNA，它们基于与靶RNA的3′端非翻译区(3′-UTR)序列互补结合，可以降解mRNA和/或抑制蛋白质翻译过程，miR的异常缺失或过表达与多种自身免疫性疾病的发生和发展密切相关[1-3]。研究报道miR-410在多种肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等疾病的发生过程中发挥重要的抑癌作用[4-6]。最近的研究表明miR-410在SLE患者中存在异常表达，且参与SLE及狼疮性肾炎的发病紧密相关[7,8]，但其与SLE发生相关详细的靶分子的调控网络仍不清楚。本研究通过生物信息学方法推测miR-410作用的靶分子在SLE的发生与发展中的分子调控网络，分析可能参与的生物学过程，为研究其在SLE发生、发展的作用和相关调控机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床标本 选择22 例2015年3月至10月在南华大学附属第一医院附属医院风湿科诊治的初诊SLE患者，其中女20例，男2例，年龄13～62 岁，平均(30.92±13.50)岁，所有患者符合美国风湿病学会(ACR)1997年分类诊断标准。正常对照组20例健康体检者，其中女18例，男2例，年龄12～59岁，平均(31.42±12.26)岁，年龄和性别与SLE患者组比较差异无明显统计学意义。

1.1.2主要试剂和仪器 人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司， 人miR-410及内参U6的引物均购自广州锐博生物技术有限公司，逆转录试剂盒为Thermo Scientific公司，2×Power Taq PCR MasterMix为北京百泰克生物技术有限公司产品，PCR 扩增仪为 Bio-Rad DNA Engine Peltier Thermal Cycle。

1.2生物信息学网站和软件 运用UCSC基因组在线软件工具(http://genome.ucsc.edu/)分析has-miR-410在人类基因组中的位置及保守性。运用Targetscan (http://www.targetscanorg/)在线网站预测has-miR-410调控的靶基因分子，Genecards数据库(http://www.genecards.org/)查询与SLE发病相关的疾病基因。采用DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)对has-miR-410预测靶基因集合进行功能富集分析(GO分析) 和基于KEGG数据库(http：//www.genome.jp/)的信号转导通路富集分析(Pathway分析)。以P<0.05为差异具有统计学意义，得到基因集合相对于背景具有统计学意义的信号转导及疾病通路。

1.3统计学处理 统计分析采用 SPSS16.0 软件进行对miR-410定量RT-PCR结果进行分析，组间比较分析采用t检验，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1miR-410在人类基因组中的位置及保守性分析用 通过UCSC基因组在线浏览工具获得miR-410在人类基因组中的位置(图1),miR-410定位于人类14q32.31人染色体上101065912-101065991位置,长度共80 bp，其核苷酸序列在人、猕猴、小鼠、狗、大象五种个体中呈高度保守。

2.2miR-410在SLE患者中的表达 对22例SLE患者及20例正常对照人群的外周血经淋巴细胞分离液分离，提取单个核细胞总RNA，逆转录后，经荧光定量PCR检测miR-410在外周血单个核细胞中的表达，结果显示，miR-410在SLE患者中的表达水平较正常对照人群明显减低(图2)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3筛选与SLE发病相关的miR-410靶基因 对人miR-410通过使用Targetscan在线预测分别获得601个潜在调控靶基因。此外，在Genecards数据库中查询与SLE发病相关的疾病基因共2 446个。将两个数据库所得基因进行对比分析取其交集,结果显示在两个数据库同时出现有FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等共61个基因，它们在细胞内信号传导通路中扮演重要角色，与细胞生长增殖、分化、凋亡等活动密切相关(表1)。

图1 miR-410在基因组位置和保守性分析Fig.1 Genomic location and conservation analysis of miR-410

2.4miR-410预测靶基因的GO分类富集分析 对miR-410潜在调控靶基因和Genecards数据库中交集出现的61个基因进一步进行GO注释信息富集分析。GO注释信息中分子功能项显示,miR-410 靶基因存在于细胞程序性死亡、细胞增殖、粒细胞分化、磷酸化反应、造血和淋巴器官的发育和免疫系统发育等多个细胞生物学过程中(表2) 。

2.5miR-410预测靶基因的KEGG信号通路分析

图2 miR-410在SLE和正常人群的表达Fig.2 Expression of miR-410 in SLE patients and healthy controlsNote: *.P<0.05.

表1 miR-410预测靶基因GO富集分析结果

表2 miR-410预测靶基因KEGG信号通路分析

图3 miR-410靶基因在 TGF-β 信号通路中的分布Fig.3 Distribution of predicted target genes of miR-410 in TGF-β signaling pathway

利用DAVID在线软件对miR-410预测的靶基因和SLE患者Genecard数据库的疾病相关基因集合进行对比分析获得的61个基因进行信号通路分析。KEGG 信号通路分析显示,这61个交集基因显著富集于肿瘤通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、胶质瘤、黑色素瘤、TGF-β、JAK-STAT 信号通路等，详情见表3，我们选取了TGF-β信号通路途径中靶基因绘制分布示意图举例说明(图3)。

3 讨论

研究表明miR与生物体细胞信号转导通路调节密切相关，它不仅可以通过调控单一或多个信号通路中的上下游靶基因蛋白的表达，还可以选择调控基因网络中的调节子如转录因子等，从而实现对细胞特定功能和表型的有效调控。本研究对miR-410在多个物种间成熟序列比对分析发现物种间其序列呈高度保守，表明该基因在不同物种中可能发挥重要的调控作用。本课题组对SLE患者和正常对照患者的外周血单个核细胞中miR-410基因表达检测发现在SLE患者其表达水平较正常人群明显降低(P<0.05)，提示其在SLE疾病的发生发展过程中可能扮演重要作用。国内学者Lin课题组最新的研究报道在SLE患者外周血CD3+/CD4+T淋巴细胞中miR-410表达较正常对照人群显著减低[7,8]，其在胞内基因表达情况与本实验的结果一致。已有大量研究发现miR-410是胞内一个重要的抑癌基因，它可以通过调控Snial、Bak1、VEGF、MDM2等靶基因的调节多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等各种细胞生物学活动[5，6，9，10]。

对 miR靶基因的寻找往往基于生物信息学分析，用于miRNA靶基因预测的软件种类很多，包括TargetScan、miRanda、TarBase、miRBase等。虽然现有的几种预测程序在技术细节上有所不同，但它们预测的基本原理相似，都是基于miRNAs与靶标的结合机制，本实验选用的TargetScan软件为了在预测的开始过程排除假阳性，首先要求seed严格配对，延伸序列直到不配对的区域，然后根据保守性原则，淘汰不具有3′UTRs保守序列的分子，最后运用RNAFold进行热力学稳定性筛选，因而其预测结果的准确性较高，也是最为常用的miR靶基因预测软件。近年来很多运用生物信息学方法预测miR靶基因再联合疾病Genecards数据库对疾病相关分子的调控网络进行前瞻性分析，都为后续实验验证获得的大量非常有价值的线索[11,12]。本研究分析Genecards数据库中与SLE相关的疾病基因与TargetScan预测得到的miR-410潜在靶基因交集包括FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等基因。FASLG基因表达产物是FAS的配体，Fas/FASL信号通路是调节免疫系统必不可少的，包括诱导活化的T细胞和细胞毒性T淋巴细胞诱导的细胞死亡，Fas/FASL异常表达与SLE患者的疾病发生密切相关[13,14]。MAPK1在SLE患者外周血单个核细胞中表达增高，并与辅助性T细胞转录因子基因共同调节T细胞功能，调控机体内炎症活动[15]。信号传导与转录激活因子3(STAT3)是细胞内重要的信号因子，与肿瘤发生的报道较多。然而，最近Lin等[8]报道在SLE患者中miR-410是一个非常重要的调节因子，它可通过靶向结合STAT3基因3′UTR调控其基因表达，继而通过胞内信号传导影响细胞IL-10基因表达，在SLE疾病的发生发展过程中发挥重要作用。

采用信息学预测方法能够快速寻找miRNA与疾病相关的分子调控网络。Gene Ontology(GO)和KEGG信号通路富集分析是预测和寻找与疾病发生相关的靶分子及其调控网络的重要方法[16-18]。本实验结果提示miR-410的潜在靶基因可能通过肿瘤通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、胶质瘤、黑色素瘤、TGF-β、JAK-STAT信号通路等参与SLE疾病发生过程中。有研究报道，JAK/STAT信号通路异常与SLE疾病发生密切相关，通过抑制JAK/STAT、NF-κB和MAPK活性，可以减轻SLE模型中肾脏的损伤程度[19,20]。Moulton等[21]报道T细胞受体通路异常导致T细胞的正常功能缺失，在SLE发病过程中扮演至关重要的角色，T细胞受体(TCR/CD3)介导的SLE患者T细胞的刺激显示增加蛋白酪氨酸磷酸化的更快的动力学细胞蛋白质，增加钙离子通量的响应，并降低IL-2的产生。此外，自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路与SLE发生的关系也被证实[22,23]。

综上所述，生物信息学预测所得信息能对miR与疾病发生关系的研究起到很好的前瞻性作用。本研究通过对miR-410进行序列分析、靶基因预测、GO分析和KEGG信号通路分析，结果显示在SLE发病过程中miR-410可能通过调控多个与SLE发病相关的靶基因，并可能参与多条信号通路的调节。上述分析揭示miR-410与靶基因信号通路可作为颇有研究价值的生物学靶标，为阐明miR-410在SLE发病过程中所涉及的靶分子调控网络提供理论基础，并为进一步深入研究其分子生物功能验证的实验指明方向。

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[收稿2016-10-12 修回2016-11-17]

(编辑 许四平)

miR-410expressionandbioinformaticsanalysisofitspredictedtargetgenesinsystemiclupuserythematosus

ZHANGJi,OUDa-Ming,HUANGLi-Fang，OUYang-Lin，ZOULi-Heng.DepartmentofRheumatism，theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

Objective:To detect expression level of miR-410 in patients with systemic lupus erythematosus (SLE),and to expose the role of miR-410 and its target genes by bioinformatics methods.Methods:Expression level of miR-410 were detected by quantitative RT-PCR in peripheral blood mononuclear cells of SLE patients,and miR-410 sequence,its target genes and Genecards database were analyzed,and analysis of GO enrichment and KEGG Pathway was further performed.Results:miR-410 expression was significantly reduced in SLE patients,and its nucleotide sequence was highly conserved among species.These genes that were predicted to be regulated by miR-410 and associated with LE pathogenesis,included FASLG,CSF2,IFNAR2,MAPK1,PLCG2,IL4 and other genes.Analysis of GO enrichment revealed that miR-410′s target genes were involved in cell growth,proliferation,programmed cell death,cell differentiation,immune system development and other biological activities.Analysis of KEGG Pathway showed that the target genes of miR-410 were significantly enriched in a series of signaling pathways including pathways in cancer,cytokine-cytokine receptor interaction,glioma,melanoma,TGF-β and JAK-STAT signaling pathway.Conclusion:miR-410 maybe directly regulate its target molecules,mediate various signal pathway networks,thus participate in the occurrence and development of SLE.

miR-410;SLE;Target gene;GO enrichment;KEGG pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.016

①本文为国家自然科学青年基金(No.81301774)和湖南省自然科学基金(No.2016JJ2108)。

张 济(1979年-)，男，博士，副教授，主要从事临床自身免疫性和血液系统疾病发病机制研究，E-mail:zhang_ji001@126.com。

R593.2

A

1000-484X(2017)06-0884-05