CXCR1、CXCR2及CXCL8在乙肝相关肝癌中的表达及临床意义①

毕惠娟 陈建民 陈静静 王 健

(安徽医科大学第四附属医院检验科，合肥230000)

CXCR1、CXCR2及CXCL8在乙肝相关肝癌中的表达及临床意义①

毕惠娟 陈建民 陈静静 王 健②

(安徽医科大学第四附属医院检验科，合肥230000)

目的：探讨乙肝相关肝癌患者外周血单个核细胞及肝活检组织CXCR1、CXCR2及CXCL8表达及其临床意义。方法：用实时荧光定量PCR法检测36例乙肝相关肝癌患者外周血PBMCs中CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA水平；SP法检测肝活检组织CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白表达水平；化学发光免疫分析法检测血清CRP水平，并对各指标进行相关性分析。结果：乙肝相关肝癌患者PBMCs中CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA水平分别为(0.952 7±0.197 2)、(0.896 9±0.173 0)、(1.771 9±0.248 9)，较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。SP结果提示，CXCR1、CXCR2及CXCL8的蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05)。乙肝相关肝癌患者血清CRP水平与PBMC内CXCR1(r=0.54,P<0.01)、CXCR2(r=0.49,P<0.01)及CXCL8(r=0.63,P<0.01)呈正相关。结论：乙肝相关肝癌患者外周血PBMCs及肝活检组织CXCR1、CXCR2及CXCL8表达明显升高，且与血清CRP呈正相关，推测CXCR1、CXCR2及CXCL8介导的信号转导过程可能在乙肝相关肝癌发病过程中发挥重要作用，为肝癌免疫干扰治疗提供新的靶点。

肝癌；CXCR1；CXCR2；CXCL8;mRNA；单个核细胞；肝活检组织

肝细胞癌是严重危害人类健康的全球性肿瘤，我国高发，每年发病率为28.71/105，占所有恶性肿瘤第4位(10.04%)，死亡率为26.04/105，占所有癌症死亡率第2位(14.42%)。众多流行病学资料显示，慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是肝细胞癌的主要病因，但其具体机制不清。目前肝癌的防治仍面临严峻的挑战，传统的放、化疗早期疗效不明显，毒副作用大，手术切除率低，复发率和转移率高。因此，阐明乙肝相关肝癌发病的分子机制，研发针对肝癌组织局部的分子靶向治疗是肝癌治疗的新方向[1]。近年来，趋化因子受体及其配体在肿瘤中的作用引起了人们的关注。它们广泛参与了细胞生长、分化、凋亡、组织损伤、肿瘤生长和转移等各种疾病的病理生理过程[2]。多数肿瘤细胞均可表达广泛的趋化因子受体，并受趋化因子受体及其配体主导的网络调控。CXCR1、CXCR2作为CXC趋化因子受体家族最重要的两个成员，分别由Holmes等[3]和Murphy等[4]先后成功克隆获得，均定位于染色体2q35，二者同源性高达77%，拥有共同配体CXCL8，在多种肿瘤性疾病中均表达升高，在肿瘤的生长、侵袭转移、耐药及血管新生等方面发挥着极其重要的作用。为了探讨CXCR1、CXCR2及其配体CXCL8在肝癌的增殖生长、侵袭转移中扮演何种作用，本文通过筛选典型的乙肝相关性肝癌患者，检测其外周血PBMCs及肝活检组织中CXCR1、CXCR2及CXCL8的表达，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料 乙肝相关肝癌患者：筛选我院2014年10月至2015年9月收治的36例乙肝相关肝癌患者，其中男21例，女15例，年龄37～70岁。临床诊断均符合原发性肝癌诊疗规范(2011年版)[5]。另选28例本市中心血站体检正常的献血者为正常对照，其中男16例，女12例，年龄28～69岁。肝活检组织：收集安徽医科大学附属医院2013年8月至2015年10月收治的乙肝相关肝癌患者肝穿与肝外伤手术切除病理标本30例(男18例，女12例)，年龄29～73岁。入选病例病理分级均符合2015年原发性肝癌规范化病理诊断指南[6]。正常对照：同期医院收治的肝移植供肝者，经病理诊断证实肝细胞正常患者12例(男9例，女3例)，年龄28～53岁。

1.1.2试剂与仪器 ABI7900荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；实时聚合酶联反应试剂盒(TaKaRa公司)；鼠抗人hCXCR1单克隆抗体(sc-7303，SANTA公司)；鼠抗人hCXCR2单克隆抗体(sc-7304，SANTA公司)；鼠抗人hCXCL8单克隆抗体(MAB208，R&D公司)。

1.2方法

1.2.1PBMC标本收集 抽取乙肝相关肝癌患者及健康对照者早晨空腹肝素抗凝全血5 ml，加入等体积Hank′s液稀释后置含2 ml Ficoll-Hypaque分离液试管中，2 500 r/min密度梯度离心20 min，收集云雾状单个核细胞层，用RPMI1640完全培养液1 500 r/min离心10 min洗涤细胞2次，收集沉淀细胞，以RPMI1640完全培养液调整悬浮细胞至1×106ml-1。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 采用SYBR Green染料法，以cDNA为模板，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，以GAPDH作为内参，每个样本设3个复孔。根据GenBank中人CXCR1、CXCR2及IL-8 mRNA序列，以Primer Express软件设计基因的特异性引物和探针，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(见表1)。PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 5 min。反应结束读取循环阈值(Ct)。根据公式ΔCt= Ct目的基因-Ct内参基因和ΔΔCt=ΔCt肝癌组-ΔCt对照组，计算2-ΔΔCt对目的基因的表达进行相对定量。

1.2.3CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白检测 常规切取3～4 μm厚的切片， 60℃烤片1 h，置于新鲜二甲苯中脱蜡后过2次蒸馏水，将切片置于3%双氧水中，微波低热3 min，阻断内源性过氧化物酶，微波修复抗原，滴加50 μl CXCR1/CXCR2/CXCL8(1∶200 稀释)单克隆抗体，置湿盒中4℃过夜(阴性对照以PBS代替一抗)，滴加50 μl HRP二抗，孵30.0%(9/30)和56.7%(17/30)；CXCR2表达阳性率为76.7%(23/30)，其中弱表达和强表达占总病例数的比例分别为26.7%(8/30)和50.0%(15/30)；CXCL8表达阳性率为93.3%(28/30)，其中弱表达和强表达占总病例数的比例分别为33.3%(10/30)和60.0%(18/30)；12例正常肝组织中CXCR1、CXCR2及CXCL8表达阳性率分别为33.3%(4/12)、25.0%(3/12)、41.6%(5/12)，阳性染色强度均较HCC组弱(见图4)。通过统计学分析，发现HCC患者肝活检组织CXCR1、CXCR2及IL-8蛋白表达较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01，见表2)。

表1 CXCR1、CXCR2和GAPDH引物和探针序列

图3 CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA与血清CRP相关性Fig.3 Relation between serum CRP and CXCR1,CXCR2,CXCL8 mRNA

表2 CXCR1、CXCR2及CXCL8在肝癌组织中的表达

图4 肝癌患者肝活检组织CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白表达Fig.4 Protein expression of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 in liver biopsy of liver cancerNote:A-C.The protein expression of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 in normal liver;D-F.The protein expression of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 in liver cancer tissues.

3 讨论

CXCR1和CXCR2是CXC趋化因子受体(CXC chemokine receptor,CXCR)家族中的两个重要成员，二者同源性高达77%，主要表达于中性粒细胞、淋巴单核细胞等各种炎症细胞表面，它们拥有共同配体CXCL8，当CXCR1/2与CXCL8特异性结合，可诱导大量炎症细胞迁移至特定感染部位，产生局部炎症免疫应答，是一类重要的非可控炎症因素[7]。机体非可控性炎症在肿瘤的发生发展进程中扮演着重要角色，如慢性胃炎与胃癌、乙型肝炎与肝癌等[8]，CXCR1/2作为肿瘤相关炎症重要参与者，在肿瘤的生长、侵袭转移、血管新生等方面发挥不可忽视的作用[9]。大量研究发现，CXCR1/2在恶性黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生、增殖、生长、侵袭转移、血管新生等方面发挥重要调控作用[10-12]。

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高、预后差，其中，HBV的慢性感染一直被认为是肝癌发生的高危因素之一，但是其具体的分子生物学机制尚不清楚。本课题旨在研究CXCR1、CXCR2及CXCL8在乙肝相关性肝癌中的表达情况和临床意义，初步阐明其在乙肝相关性肝癌发生中的作用，为乙肝相关性肝癌的防治提供可靠的理论依据和新的治疗靶点。

在本研究中，通过实时定量PCR法检测36例乙肝相关性肝癌患者PBMCs内CXCR1/2及CXCL8 mRNA水平，发现肝癌患者PBMCs内CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA均较正常对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。Welling等[13]比较了90例肝癌和180例肝硬化患者血清多种细胞因子表达，发现只有IL-8表达水平有显著差异，并且IL-8水平越高，疾病进展越快，预后越差，这说明高水平的IL-8可能促进肝硬化向肝癌的发展。Ren等通过ELISA法检测59例肝癌患者和15例体检健康者血清IL-8浓度，结果发现血清IL-8水平与肿瘤大小，疾病分期呈明显正相关，综上所述，推测高水平CXCL8可能通过上调其受体CXCR1/2表达，调控肝癌患者局部及全身炎症免疫反应，参与乙肝相关性肝癌的发生发展进程[14]。

本研究进一步通过SP免疫组化法检测HCC患者肝活检组织CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白水平，结果显示，肝癌患者肝活检组织CXCR1、CXCR2及CXCL8蛋白水平较正常对照均明显升高(P<0.01)，此与王吉荣等[15]研究结果一致。Xue等[16]通过对比观察四种转移潜能由低到高人肝癌细胞株(SMMC-7721,MHCC97-L,MHCC97-H,HCCLM6)趋化因子受体谱表达，发现高转移潜能组HCCLM6表达谱中CXCR1(P=0.006)表达明显高于低转移潜能组SCMMC-7721，提示 CXCR1与HCC侵袭转移密切相关。以上结果都进一步证实肝癌细胞可通过分泌高水平的CXCL8，诱导CXCR1/2高表达，在肝癌的发生发展、侵袭转移等方面发挥着极其重要的作用。

CRP是一种急性时相反应蛋白，当机体炎症、感染或急性组织损伤时，由肝脏迅速合成，激活补体，活化免疫细胞，具有调理素作用。近年来大量研究发现恶性肿瘤患者血清中CRP均有不同程度升高，目前已广泛应用于临床肿瘤的辅助诊断、病情活动评估与疗效判断[17]。本研究通过相关性分析，发现HCC患者血清CRP与CXCR1、CXCR2及CXCL8 mRNA呈明显正相关，这表明CXCR1/2与CXCL8与肝癌患者肝组织的炎症活动程度和损伤程度密切相关，随着肝损伤程度增大和炎症活动程度的增强，CXCR1/2与CXCL8表达升高，提示CXCR1/2与CXCL8参与肝癌患者疾病进程，通过动态监测CXCR1/2与CXCL8水平，有助于了解肝细胞损伤程度，对早期发现肝癌、减少肝癌漏诊及判断预后意义重大。

综上所述，乙肝相关性肝癌患者体内CXCR1、CXCR2与其配体CXCL8明显升高，可能通过激活下游信号通路，诱导机体局部及全身炎症反应，调节肿瘤血管新生，在肝癌的发生、增殖生长、侵袭转移等方面发挥重要调控作用，同时也为乙肝相关肝癌的免疫干预治疗提供新的方向。

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[收稿2016-10-13 修回2016-11-23]

(编辑 张晓舟)

ExpressionsandclinicalsignificanceofCXCchemokinereceptor1and2andCXCL8inhepatitisBrelatedhepatocellularcarcinoma

BIHui-Juan,CHENJian-Min,CHENJing-Jing,WANGJian.DepartmentofClinicalLaboratory,theFourthAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230000,China

Objective:To investigate the expression levels of CXCR1，CXCR2 and their common ligand CXCL8 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and liver biopsy from the patients with hepatitis B related hepatocellular carcinoma and their clinical significances.Methods:Quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the mRNA levels of CXCR1,CXCR2,CXCL8 in the peripheral blood mononuclear cells of thirty-six hepatitis B related hepatocellular carcinoma and the protein levels of CXCR1 and CXCR2 and CXCL8 in liver biopsy were detected by SP immunohistochemical method.The level of C-reactive protein in serum was determined by chemiluminescence immunoassay respectively.Then,the correlations between CRP and the mRNA of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 were analyzed.Results:The mRNA levels of CXCR1 (0.952 7±0.197 2),CXCR2 (0.896 9±0.173 0),CXCL8 (1.771 9±0.248 9) in the PBMCs of hepatitis B related hepatocellular carcinoma were significantly higher than those in controls (P<0.01).And the protein levels of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 were also obviously increased in liver biopsy of hepatitis B related hepatocellular carcinoma (P<0.05).In addition,there was positive correlations between the level of serum C-reactive protein and the mRNA expression of CXCR1(r=0.54,P<0.01),CXCR2(r=0.49,P<0.01),CXCL8(r=0.63,P<0.01).Conclusion:The levels of CXCR1,CXCR2 and CXCL8 significantly increased in hepatitis B related hepatocellular carcinoma patients and positively correlated with serum CRP,suggesting that CXCR1,CXCR2 and their common ligand CXCL8 signal transduction process may play a key role in the pathological process of hepatitis B related hepatocellular carcinoma,which may provide a new direction for the immune intervention therapy of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma;CXCR1;CXCR2;CXCL8;mRNA;PBMC;Liver biopsy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.018

①本文为安徽医科大学校级基金(2015xkj049)、安徽省自然科学基金(1308085MH148)和安徽省教育厅自然科学研究项目(KJ2016SD20)。

②安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，淮南232001。

毕惠娟(1987年-)，女，硕士，主管技师，主要从事病毒性肝炎与分子免疫方面的研究。

及指导教师：王 健(1962年-)，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事病毒性肝炎与免疫学方面研究，E-mail:wangjian8237@sina.com。

R392.1

A

1000-484X(2017)06-0895-05