气道吸入中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对颅脑损伤误吸致肺损伤大鼠炎性因子及免疫功能的影响

荣 燕 江智霞 黄大可

(安徽中医药大学,合肥230012)

气道吸入中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对颅脑损伤误吸致肺损伤大鼠炎性因子及免疫功能的影响

荣 燕 江智霞①黄大可②

(安徽中医药大学,合肥230012)

颅脑损伤(Brain injury)患者咽反射消失，食物或口咽分泌物容易误吸进入肺内，导致急性吸入性肺损伤(Acute lung injury,ALI)，处理不及时还可能出现急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，甚至造成患者死亡[1]。目前颅脑损伤继发肺损伤发病机制尚不明确，可能与活化中性粒细胞(Polymorphonulear leukocyte,PMN)释放细胞因子与过度炎症反应密切相关。中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)是PMN释放的一种蛋白酶，是引起炎症反应与免疫异常的终效因子，可介导并引起肺损伤[2]。西维来司钠(Sivelestat sodiom)是一种中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)抑制剂，可以有效抑制NE，阻止并减轻中性粒细胞介导的肺损伤反应[3]。西维来司钠临床上多采用全身静脉给药，局部药物浓度有限，给药剂量大，药物作用受限，且副作用明显。雾化吸入能使药物直接到达终末支气管及肺泡，局部药物浓度高，能最大程度发挥药效[4]。本文通过动物实验研究的方法，探讨雾化吸入西维来司钠对颅脑损伤误吸致肺损伤大鼠模型炎性因子、免疫功能的影响，旨在揭示其治疗的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 60只SD大鼠，均为雄性，体重270～340 g，平均(312.53±7.89)g。购自安徽医科大学动物实验中心(许可证号：AHCK2015-0012)，采用随机数字表法分为健康对照组、模型组、生理盐水组、地塞米松组、西维来司钠组各12只。饲养条件：室温(25.21±0.56)℃，相对湿度50%～60%，常规进食、饮水，适应性饲养1周后进行试验。

1.1.2主要仪器与试剂 雾化治疗器：德国百瑞公司PARI Turbo BOY 型；高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂TGL-16型；光学相差显微镜：日本Olympus公司CKX41型；病理图像分析系统：Germany公司Leica Qwin standard 2.8；恒温冰箱：天津泰斯特仪器有限公司HH-W21-60型；全自动生化分析仪：日本日立7600型；流式细胞式：贝克曼库尔特Gallios型。

西维来司钠：上海巨龙药物研究开发有限公司，批号：20151210；NE、IL-8、IL-4、IFN-γ、趋化因子CCL3、趋化因子CCL5等试剂均购于北京晶美生物工程有限公司；BALF白蛋白试剂购自海德诊断系统有限公司。

1.2方法

1.2.1颅脑损伤误吸致肺损伤模型 所有大鼠适应性饲养1周，除健康对照组外，其余四组大鼠采用改进型Marmarou法建立颅脑损伤大鼠模型：将大鼠头部置BI装置的导引下，用100 g的撞击锤从50 cm 高处经引导管下滑，致使大鼠重度脑损伤。见大鼠有呼吸抑制、肢体抽蓄、昏迷及肢体活动障碍为重度脑损伤造模成功。

随后向大鼠腹腔内注射10%水合氯醛0.33 mg/kg，麻醉大鼠后，将其仰卧固定于操作台上，常规消毒后，切开颈部皮肤表层，分离气管，头向下倾斜30°，将提前收集的鼻饲患者的胃液(0.4 ml/kg)经大鼠气管滴入，建立颅脑损伤误吸模型，大鼠逐层缝合后归笼。

1.2.2分组试验 参考权明桃等[5]方法，颅脑损伤误吸模型建立后，除重度脑损伤组大鼠不作处理外，其余3组大鼠分别置入30 cm×15 cm×20 cm的玻璃箱中，给予不同的药物溶液雾化吸入。地塞米松组用地塞米松6.25 mg/kg+0.9%氯化钠10 ml雾化吸入，西维来司钠组用西维来司钠1.25 mg/kg+0.9%氯化钠10 ml雾化吸入，每次20 min，3次/d，连续治疗3 d。

1.2.3观察指标

1.2.3.1NE、IL-8及白蛋白含量 治疗3 d 后，于气管下段作“T”形切口，将5 ml预冷生理盐水缓慢注入肺内，反复灌洗5次，取支气管肺泡灌洗液(BALF)5 ml，3 000 r/min离心15 min取上清液，采用酶联免疫吸附法检测NE、IL-8含量，采用免疫透射比浊法测定BALF中白蛋白浓度。

1.2.3.2γ-IFN、IL-4、CCL3及CCL5含量 治疗3 d 后，经腹主动脉取血6 ml，3 000 r/min离心10 min取血清，采用ELISA法测定IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量。

2 结果

2.1NE、IL-8及白蛋白含量比较 模型组NE、IL-8、白蛋白含量明显高于健康对照组(P<0.05,P<0.01)；地塞米松组、西维来司钠组NE、IL-8、白蛋白含量明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)；西维来司钠组NE、IL-8、白蛋白含量明显低于地塞米松组(P<0.05)。见表1。

2.2IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量比较 模型组血清IFN-γ、CCL3、CCL5含量明显高于健康对照组，IL-4含量明显低于健康对照组(P<0.05,P<0.01)；西维来司钠组、地塞米松组血清IFN-γ、CCL3、CCL5含量明显低于模型组，IL-4含量明显高于模型组(P<0.05,P<0.01)；且西维来司钠组、地塞米松组血清IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨论

急性肺损伤是重度脑损伤的常见并发症，常发展为ARDS导致患者呼吸衰竭甚至死亡。重型颅脑损伤后继发吸入性肺炎的发病机制比较复杂，目前认为与肺内过度性、失控性炎症反应导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛破坏有关[6]。

严重颅脑损伤后，应激反应及颅内压升高等因素，引起交感神经兴奋，全身血管收缩，组织缺血缺氧，使中性粒细胞处于激活状态；如因误吸再次发生急性肺损伤，则使处于激活状态的炎性细胞释放大量的炎性介质，其中NE可直接降解细胞外基质的多种蛋白成分，增加血管通透性，诱导内皮细胞产生趋化性细胞因子，使IL-8等大量释放，引起过度失控的炎症反应，进而导致ALI的发生[7]。大剂量糖皮质激素冲击疗法是治疗ALI的主要方法。地塞米松具有广泛的抗炎作用，能降低肺泡-毛细血管的通透性，减少渗出，降低INF-α、白介素类炎性因子的水平，抑制炎性反应，减轻肺损伤。西维来司钠是一种NE抑制剂，在炎症局部可有效抑制弹性蛋白酶，减轻肺组织损伤[8]。通过雾化吸入可使药物直达肺泡，能减轻ALI肺部炎性因子、PMN的活化，减少炎性反应对肺组织的直接损伤[9]。丁云丽等[10]认为，西维来司钠能明显抑制ANP肺损伤大鼠促炎细胞因子的释放和表达，有效保护急性胰腺炎肺损伤。王一贺等[11]发现，西维来司钠保护肺组织的机制是通过改善血气分析指标、减轻肺水肿、降低血清中炎症因子水平实现的。本文研究中，西维来司钠组支气管肺泡灌洗液(BALF)中NE、IL-8、白蛋白含量明显低于模型组与地塞米松组，与上述文献报道结论基本相似。

表1 各组大鼠BALF中NE、IL-8及白蛋白含量的比较

Note：Compared with health control group，t=10.728-31.107,1)P<0.01；compared with model group，t=4.204-26.179,2)P<0.05；compared with Dexamethasone group，t=3.799-8.634,3)P<0.05.

表2 各组大鼠血清IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量的比较

Note：Compared with health control group，t=10.728-31.107,1)P<0.01；compared with model group，t=4.204-26.179,2)P<0.05；compared with Dexamethasone group，t=3.799-8.634,3)P<0.05.

“二次打击”理论认为，当机体受到第一次打击时，炎性因子与免疫细胞均处于激活状态，如果再次受到第二次打击，将会使处于激活状态的炎性细胞大量释放，免疫功能降低[12]。颅脑损伤所致误吸对肺组织的第二次打击，既往多认为是胃液酸性物质与消化酶对肺组织的直接损伤，随着研究的不断深入，误吸不仅直接导致肺毛细血管通透性增加，也造成肺内炎性细胞因子过度分泌，导致免疫功能紊乱[13，14]。T淋巴细胞参与机体的免疫调节。CD4+细胞主要分为Th1、Th2细胞两类，IFN-γ主要由Th1细胞分泌，能调节中性粒细胞募集，是一种促炎因子；IL-4由Th2分泌，能抑制IFN-γ分泌，发挥强大的抗炎作用[15]。CCL3及CCL5均为趋化因子之一，能调节并活化正常T细胞的表达与分泌，从而参与机体的免疫过程[16]。周游等[17]对实验性自身免疫性脑脊髓炎模型大鼠的研究中，报道西维来司钠可增强自身免疫性脑脊髓炎模型大鼠血清IL-4含量，且呈剂量依赖性关系。本文研究表明，西维来司钠外周血中IFN-γ、CCL3及CCL5含量明显低于模型组，IL-4含量明显高于模型组，提示西维来司钠可能提高调节机体免疫功能来发挥抗炎效果。

本文研究结果表明，西维来司钠气道雾化吸入治疗对颅脑损伤误吸致肺损伤大鼠肺组织有一定的保护作用，可能与抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性、减少炎性细胞浸润、调节机体免疫功能等因素有关。需要指出的是，本文仅为实验性研究，缺乏对不同剂量西维来司钠雾化吸入治疗的比较，且对可能作用机制分析不够深入，更准确的结论还有待于更多的基础研究与临床研究去求证。

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[收稿2017-01-06]

(编辑 倪 鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.023

①遵义医学院第一附属医院，遵义563003。

②安徽医科大学，合肥230000。

荣 燕(1982年-)，女，硕士，讲师，主要从事医学教育方面的研究，E-mail：409078107@qq.com。

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1000-484X(2017)06-0919-03