响应面优化纤维素酶法破壁提取油菜蜂花粉总黄酮的工艺

曹玉瑶，董 增，曹稳根

（宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000）

响应面优化纤维素酶法破壁提取油菜蜂花粉总黄酮的工艺

曹玉瑶，董 增，曹稳根

（宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000）

采用纤维素酶法破壁提取油菜蜂花粉总黄酮，以总黄酮得率为指标，研究了料液比、酶解温度、酶解时间对总黄酮得率的影响，并利用响应面法优化酶解破壁提取工艺。 响应面法优化结果表明，最佳工艺条件为料液比 1∶51，酶解温度 50℃，酶解时间为 5.6h。在此条件下，总黄酮得率为（10.34±0.05）%。 通过对酶解处理前后油菜蜂花粉表面的扫描电镜观察，表明纤维素酶具有很好的破壁作用，能促进总黄酮等内容物的释放，提高总黄酮的得率。

油菜蜂花粉；纤维素酶；总黄酮；响应面优化

油菜 蜂花粉（Rape bee pollen）是蜜 蜂 采 集 油 菜花粉时加上蜜蜂自身的腺体分泌物（花蜜和唾液）混合 而成 了一种 不 规则扁 圆 形状物[1]。 蜂 花 粉除了 含 有蛋白质、糖类和不饱和脂肪酸等营养成分，还含有丰富的 黄 酮 类 物 质[2，3]。 研 究发现 蜂 花 粉 具 有 保 护 心 血管、增强免疫力、抗癌、抗氧化、抑制前列腺疾病等生理功效，可以应用于医药、保健食品、美容等行业，具有 广泛 的应用 价 值[4-8]。

油菜蜂花粉虽然具有较高的应用价值，但是花粉细胞壁的存在影响了其利用价值。花粉细胞壁分为内壁和外壁，孢粉素和纤维素组成的外壁抗酸碱、耐高温，内壁则由纤维素和果胶构成，萌发孔是各种营养成分释放的唯一通道，导致花粉的营养利用率低[9]。 目 前 ，破 壁 的 方 法 主 要 有物理 法 （如 机 械 法 、超声波处理及温差解冻法等）、生物法（发酵破壁、酶解破壁 等）和化 学 破壁等[10]。 其中 ，酶法破 壁 条件 温 和 、对 热 敏 性 物 质 破 坏 小 而 被 广 泛 应 用 。 董 亚 婷 等[11]利用纤维素酶和碱性蛋白酶处理蜂花粉，提取的酚类物 质 和 其 抗 氧 化 性 都 得 到 提 高 ；高 鲲 等[12]研 究 了 复合蛋白酶酶解油菜蜂花粉，获得最佳酶解条件为pH8、温度 48℃、时间 48h，并对其表征进行了分析；董 捷 等[13]研 究 了 酶 法 处 理 对 油 菜 花 粉 萌 发 孔 通 透 性的影响，发现复合蛋白酶+复合纤维素酶处理花粉后，萌发孔打开最明显。很多学者关注于酶处理对花粉营养物质的溶出及花粉结构的影响，缺少工艺的研究。

因此，本文采用纤维素酶酶解破壁法对油菜蜂花粉进行处理，用乙醇加热回流法提取黄酮，以黄酮含量为指标，采用响应面优化设计优选出蜂花粉破壁最优工艺条件，并用电镜观察破壁前后花粉表面的构造，为油菜蜂花粉的综合利用提供工艺研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油菜蜂花粉：青海省门源县昆珍土特产南贸有限公司；芦丁标准品：上海源叶生物科技有限公司；纤维素酶（50u/mg）：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

U-3310 型紫外分光光度计, 日本 Hitachi公司；Su1510 型电子扫描显微镜， 日本 Hitachi公司；RE-52 型旋转蒸发器， 上海青浦泸西仪器厂；DHG-924OA 鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将购置的油菜蜂花粉原料于 50℃烘箱中干燥2h，控制其水分含量在 5-10%之间，将蜂花粉研磨成粉末状过 80 目筛，在紫外灯照射下灭菌处理，装入干燥的磨口瓶中，置于干燥器中备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品 0.005g 用80%乙醇完全溶解 （可稍加热或使用超声波辅助）后， 定容至于 25mL 容量瓶得到 0.2mg/mL 的芦丁标准液。 分别准确吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL上述芦丁标准液于 25mL 比色管中， 用 80%乙醇溶液定容至 10mL， 然后向每个试管中各加入 5%亚硝酸 钠溶 液 0.7mL，反 应 6min，依次 加入 0.7mL10%硝酸铝溶液，摇匀后静止 6min，再依次加入 5mL10%氢氧化钠溶液混合均匀， 用 80%乙醇溶液定容至25mL，静置。 15min 后进行扫谱，得到最大吸收峰为510nm，然后于 510nm 处测吸光度，平行 3 次。 以芦丁标准溶液浓度 x（mg/mL）为横坐标，吸光度 y 为纵坐标，得回归方程为 y=8.5536x-0.006，相关系数 R2= 0.9990，总黄酮在 0-0.048mg/mL 浓度范围内与其 吸光度呈现良好的线性关系。

1.3.3 油菜蜂花粉总黄酮酶解破壁提取液的制备

准确称取 3g 预处理样品，按一定的料液比加入质量分数为 2%的纤维素酶溶液，在特定的温度下处理一定时间。酶解结束后，75℃热水中灭酶 10min，冷却后将酶解液转入圆底烧瓶中减压抽滤。再加入80%的乙醇 60mL，80℃下回流提取 3h。 提取完毕，用与 80%乙醇反复洗涤， 定容于 100mL 容量瓶中，即得油 菜蜂花 粉 总黄酮 酶 解破壁 提 取液[14，15]。

1.3.4 油菜蜂花粉酶解破壁提取液中总黄酮含量

精 确吸 取 0.5mL 提 取 液 置 于 25mL 的 比 色 管中，用 80%乙醇稀释到 10mL 处，加人 5%的亚硝酸钠溶液 0.7mL，混匀，放置 6min；加入 0.7mL10%硝酸铝溶液，摇匀，静置 6min，再加入 5mL10%的氢氧化钠溶液， 混匀， 加入 80%的乙醇溶液定容，摇匀，15min 后于波长 510nm 处测定其吸光度， 同时做 3组平行实验，黄酮得率计算公式如（1）：

1.3.5 单因素试验

以油菜蜂花粉总黄酮提取率为指标，通过改变料液比、酶解温度、酶解时间某一单因素值，分别考察料液比、酶解温度、酶解时间对破壁提取油菜蜂花粉总黄酮提取率的影响，以确定破壁提取总黄酮的最佳条件。

1.3.6 响应面优化酶解法破壁提取油菜蜂花粉总黄酮的工艺

参 考 董 增[16]方 法 ， 在 单 因 素 试 验 结 果 基 础 上 采 用Design-Expert软件进行响应面设计。 以-1，0，1 代表自变量水平，以油菜蜂花粉总黄酮得率为指标进行优化。

1.3.7 表面结构观察

用牙签挑取少量处理过的蜂花粉粉末粘在贴了双面胶的样品台上，用洗耳球吹去未粘附的样品，喷金后用扫描电子显微镜观察样品的表面结构。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对破壁提取油菜蜂花粉总黄酮提取率的影响

由图 1 可知，当料液比小于 1∶50 时，随着料液比的增加，黄酮得率上升；当料液比为 1∶50 时，黄酮得率最高；超过 1∶50 时，总黄酮得率出现下降。 因此，选取 1∶50 为佳。

图1 料液比对黄酮得率的影响

2.1.2 酶解温度对破壁提取油菜蜂花粉总黄酮提取率的影响

由图2可知，总黄酮得率随着温度的升高不断上升，但是当温度超过 50℃的时候得率反而下降，说明纤维素酶活性的最适温度在 50℃左右。 因此，50℃为最适酶解温度。

图2 酶解温度对黄酮得率的影响

2.1.3 酶解时间对破壁提取油菜蜂花粉总黄酮提取率的影响

由图3可知，提取时间的延长能够提高总黄酮的得率，但是当提取超过 5h 时，总黄酮的得率下降。因此，选取 5h 为因素时间的中心点。

图3 酶解时间对黄酮得率的影响

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面试验设计

为了使酶解破壁提取工艺更加科学，在单因素试验的基础上，选取料液比、酶解温度、酶解时间为因素，以总黄酮得率为响应值，根据 Box-Behnken 原理设计3因素3水平响应面实验，实验因素水平和编码见表1。

表1 响应面实验因素水平表

2.2.2 二次多元回归模型分析

表2是响应面试验设计和结果，结果利用Design Expert 8 软件进行响应面分析， 得到回归方程为（2）:

表2 响应面试验设计与结果

分析结果如表 3 所示。 该模型 P＜0.0001，表明该回归模型非常显著；失拟项 P=0.4015＞0.05，不显著，相关系数 R2=0.9882 和调整系数 Adj.R2=0.9662 也表明该回归模型对试验结果拟合较好，试验误差较小，因此该回归模型设计与实验结果基本一致。

表3 回归模型显著性检验及方差分析

从各个因素的显著性水平差异可知，对油菜蜂花粉黄酮得率的影响次序为：酶解时间 X3＞酶解温度X2＞料液比 X1。 酶解时间 X3、酶解温度 X2、料液比 X1的二次项对总黄酮得率的影响都达到了极显著水平（P＜0.001）；料液比 X1、酶解时间 X3的交互项 X1X3对总黄酮的得率有显著（P＜0.05）的影响。

响应面三维模型如图 4 所示。 从图 4a中可看出，料液比和酶解温度交互作用显著，随着料液比的减小，总黄酮的提取率先增加再减少，溶剂的增多，能够使溶剂和溶质间具有较高的浓度差，利于传质的进行，促进总黄酮的溶出，但是过多的溶剂酶和底物不能够很好的结合，并使后继处理困难，因此，溶剂与蜂花粉的配比在合适的范围内才利于总黄酮的提取。同样，总黄酮的提取率也是随着温度的升高，先升高再降低，这是由于酶的活性有最适的温度，高于或低于此温度都会使酶的活性降低。

图4b反应了料液比和酶解时间对于总黄酮提取的交互作用，在图中我们可以看出，随着时间的延长，提取率先升高后降低。 这可能是因为时间太短，酶的活性能力没有被充分利用，而时间过长导致部分 酶 失 去 活 性 ，使 得 提 取 率 降 低[17]。 图 4c 是 酶 解 温度和酶解时间的交互作用，总黄酮的提取率随着温度的升高和时间的延长迅速增大，但是过高的温度和过长的时间都会导致提取率的下降。

图4 两因素交互作用对破壁提取油菜花粉总黄酮提取率影响的响应面图

2.2.3 最优工艺条件确定及验证

运用响应面法优化设计最佳条件为： 料液比1∶50.58，恒温 水浴温度 49.74℃，时 间 5.62h，在此 提 取条件下，总黄酮得率的预测值为 10.348%。 考虑到实际实验条件，将工艺条件简化为：料液比 1∶51，温度50℃，时间 5.6h，在此条件下重复 3 次实验，测得黄酮 的 得 率为 （10.34±0.05）%，与 预测 值 接 近 ，表 明 该模型设计成功，该模型能够很好的预测油菜蜂花粉总黄酮的得率。

2.3 形态分析

图5反映蜂花粉纤维素酶处理前和处理后不同放大倍数的电镜扫描照片对比结果。 图（5a，5b）是酶处理前样品不同放大倍数下的表面形态，此时花粉粒呈规则的椭圆形，萌发孔表面有覆盖物附着而没有显露出来。 图（5c，5d）是加酶处理后不同放大倍数下的花粉粒，内部结构显现出来，能够清楚的观察到花粉破裂显现出多孔的结构，花粉粒缩小成球形，花粉内部的营养物质可以方便的溶出。因此可以得出，纤维素酶能够很好的破坏油菜蜂花粉壁，改善细胞壁的通透性，利于内容物的释放。

图5 纤维素酶处理前（5a,5b）和处理后（5c,5d）蜂花粉的扫描电镜照片

3 结 论

采用响应面法优化了纤维素酶破壁提取油菜蜂花粉总黄酮的工艺，最佳工艺条件为料液比 1∶51，温度 50℃， 时间 5.6h。在此条件下， 总黄酮得率为（10.34±0.05）%，与预测值 10.348%基本一致。纤维素酶处理前后不同放大倍数油菜蜂花粉的扫描电镜对比照片表明纤维素酶具有很好的破壁作用，改善了蜂花粉细胞壁的通透性，促进其内容物溶出，提高总黄酮得率。

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责任编辑：胡德明

Response Surface Optimization of Total Flavonoids Extracted from Rape Bee Pollen by Cellulase

Cao Yuyao,Dong Zeng,Cao Wengen
（School of Biological and Food Engineering,Suzhou University,Suzhou 234000,China）

Total flavonoids from rape bee pollen were extracted by using cellulase wall-breaking method,and with the extraction yield of total flavonoids as investigation index,the effects of solid-liquid ratio,enzyme extraction temperature,extraction time on the extraction yield of total flavonoids were discussed.The process was optimized with response surface methodology.The optimization results of RSM indicated that the extraction yield of total flavonoids was (10.34±0.05)%under the optimum processing condition with the solid-to-liquid ratio of 1:51,the temperature of 50℃ and the hydrolysis time of 5.6 h.An SEM observation of the surface of rape bee pollen before and after enzymolysis treatment indicated that cellulase played an important role in breaking walls,stimulating the release of such contents as total flavonoids and improving the extraction yield of total flavonoids.

rape bee pollen;cellulase;total flavonoids;response surface optimization

S896.4

：A

：1672-447X（2017）03-0053-05

2016-11-16

宿州区域发展协同创新中心学生开放课题（2015SZXTXSKF05）

曹玉瑶(1995-)，安徽宿州人，宿州学院生物与食品工程学院，研究方向为药物化学；

曹稳根(1964-)，安徽东至人，宿州学院生物与食品工程学院教授，研究方向为生物化学及天然产物化学。