大鼠脊髓不同程度损伤后早期血清中NSE和S-100β的表达①

王崇禧，周成福，苏 航，张增增

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

大鼠脊髓不同程度损伤后早期血清中NSE和S-100β的表达①

王崇禧，周成福，苏 航，张增增

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探索大鼠正常及不同程度脊髓损伤(SpinalCordInjury，SCI)后血清中神经元特异性烯醇化酶(NSE)和星形胶质源性蛋白(S-100β)的表达及规律。方法：取54只SD大鼠，随机分成A、B、C、D、E、F6组。前4组选取改良Allen’s法建造不同程度SCI样本，至伤能量经预实验后选择如下：A组(2.5cm×10g)、B组(4.5cm×10g)、C组(6.5cm×10g)、D组(8.5cm×10g)E组仅显露脊髓，不致伤，F组正常观察。打击后大鼠发生摆尾，双下肢及机体回缩，进而双下肢自然松弛术，表明打击确实，后行改良体感诱发电位(somatosensoryevokedpotential,SEP)检测，评估脊髓损伤程度的可信性，去除不合格模型。术后3h、6h、12h、48h、72h时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量分析各组大鼠血清中NSE和S-100β变化。术后7d时行改良SEP评估神经功能损伤与恢复情况。结果：①在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。②一定损伤程度范围内，ABCD四组模型相同时间点血清中NSE和S-100β定量分析较正常增多，损伤各组间检测结果比较有差别(P<0.05)，脊髓损伤程度越重，血清中NSE和S-100β两者阳性表达结果增加，脊髓损伤后6h，二者阳性表达达到最大值，呈正相关关系。③通过本实验的数据分析，大鼠在轻度致伤后血清中NSE含量表达平均值达到6.26ng/mL，远远高于正常大鼠组。NSE和S-100β在本文的研究中发现不具有相关性。结论：①在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。②一定损伤程度范围内，随着损伤程度的增进，大鼠血清中NSE和S-100β表达有所升高，且与脊髓损伤的程度呈正相关，即：随着程度的不断加大，NSE和S-100β的阳性表达结果逐渐增多；大鼠脊髓损伤后6h的阳性表达量到达最大值，明显高于对照组。因此可以认为一定程度上NSE和S-100β检测可以作为评判、估计脊髓损伤程度的一种方法。③从本文数据分析，我们可以认为当大鼠血清中NSE含量大于6.26ng/mL时可能出现了脊髓的损伤，这有一定意义存在。NSE和S-100β两者在研究中发现不具有相关性，这还需要我们进一步的探索。椎板切除术操作不会明显影响大鼠血清中NSE和S-100β的定量分析以及改良SEP的检测。

脊髓损伤；NSE；S-100β；血清；大鼠

SCI发病较为常见，常引起损伤平面以下感觉、运动、反射、植物神经功能紊乱，大小便失禁及性功能障碍，严重影响了病患及其家庭。烯醇化酶同工酶中的αγ及γγ型独特地存在于神经元和神经内分泌细胞中，所以叫作神经元特异性烯醇化酶(NSE)。NSE绝大部分在中枢神经系统的灰质内，损伤的神经细胞变性坏死，得以释放的NSE可通过血-脊髓屏障而进入外周血。S-100β可体现、揭示胶质细胞的损伤，是白质异常的标记[1]。损伤等因素活化胶质细胞而过度表达S-100β，使星形胶质细胞等形成致炎性因子以及一氧化氮，引发神经细胞功能障碍甚至死亡[2～5]。本研究采取ELISA试验定量分析血清中的NSE和S-100β，以期为精确判断、评估不同程度SCI提供一种新手段。

1 材料与方法

1.1 实验对象

取健康SD大鼠54只，体重(220±10)g。随机分成A～F共6组大鼠，每组9只。

1.2 制作模型和相关检测

采取Allen's法建造不同程度SCI的大鼠模型。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉(腹腔注射)成功后固定体位，去毛、消毒、铺大小适宜无菌巾。取T10棘突为中心作后正中切口，严格参照手术入路规范及解剖特点，显露出T10棘突后，仔细咬除T9～T11棘突及全部椎板，合理、适度显露椎管及硬脊膜。于T10段脊髓上安放垫片，取打击圆柱从不同高度处释放。至伤能量经预实验后选择如下：A组(2.5cm×10g)、B组(4.5cm×10g)、C组(6.5cm×10g)、D组(8.5cm×10g)，标记发生摆尾，双下肢及机体回缩，进而双下肢自然松弛的大鼠，说明建造模型打击确实[6,7]。术后立即进行改良SEP检测，综合评断脊髓损伤程度的可信性，剔除不合格模型并予以补充。E组仅显露脊髓，余操作与实验组一致，以青霉素溶液冲洗术区后逐层缝合组织，F组正常观察。术后注射抗生素，大鼠室温下自由喂养，大鼠8h排尿一次，定时取血检样。

1.3 改良体感诱发电位(SEP)

麻醉满意后稳固鼠头，消毒，取顶正中切口，依次切开组织后以纱布擦去骨膜，使颅骨显露面大小适宜。在矢状缝左侧冠状缝后缘处，以牙科钻钻孔，孔无需打穿，保留薄层骨质，避免损伤颅脑。记录并保存SEP波形叠加、平均处理后的数据。及时观察术后及术后7d时大鼠SEP变化。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠脊髓不同程度损伤后NSE和S-100β定量分析：大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。一定损伤程度范围内，ABCD四组模型相同时间点血清中NSE和S-100β定量分析较正常增多，损伤各组间检测结果比较有差别(P<0.05)，脊髓损伤程度越重，血清中NSE和S-100β含量增多,改良SEP恢复情况及后期症状改善越差(P<0.05)。大鼠不同程度脊髓损伤NSE和S-100β定量分析结果见表1～2，图1～2。

图1 NSE检测标准曲线

组别ABCDEF3h6.26±1.148.20±1.1410.10±1.8316.03±1.351.74±0.351.27±0.396h10.67±1.4114.00±1.2717.46±2.3819.86±1.931.69±0.381.69±0.1912h9.19±1.6611.88±0.9515.14±1.8317.69±1.401.56±0.391.55±0.5348h8.85±1.2410.87±1.1915.31±0.9916.77±1.011.65±0.271.61±0.30

图2 S-100β检测标准曲线

组别ABCDEF3h0.26±0.020.31±0.040.35±0.030.39±0.050.08±0.0050.08±0.0066h0.36±0.030.62±0.030.76±0.050.87±0.050.08±0.0060.08±0.00412h0.30±0.020.52±0.070.59±0.050.71±0.050.08±0.0070.07±0.00648h0.31±0.020.51±0.080.59±0.020.67±0.020.08±0.0070.08±0.004

2.2 一定损伤程度范围内，大鼠模型脊髓损伤越重，改良SEP恢复情况及后期症状改善越差(P<0.05)。见表3～4。

表3 各组不同时间SEP潜伏期,单位：ms)

表4 各组不同时间SEP波幅，单位：μv)

2.3 研究NSE和S-100β相关性的研究(pearson相关性=0.022，单位：ng/mL)，见图3。

图3 血清中NSE和S-100β的散点图

该实验结果表明两者之间没有相关性，结果可能受样本数据及操作手法、试剂盒敏感程度的影响，我们还需要进一步的验证与考量。

3 讨论

SCI常引起损伤平面以下感觉、运动、反射减弱或消失，植物神经功能紊乱，大小便失禁及性功能障碍，造成患者严重病废。患者有时影像学检查上表现轻，脊髓外观上保持完整并且连贯，但却出现丧失大部分或者全部脊髓功能的症状，甚至产生严重后遗症。现阶段，对病人进行正确的神经系统体格检查，参考影像学等辅助检查，可以诊断出脊髓是否受损。但是在早期判断其损伤的程度仍有一定困难，其手术适应征在选择上尚不非常明确和严谨，叶春平通过研究后认为，在无骨折脱位型颈髓损伤中，JOA评分轻、中度患者可不必早期进行手术治疗。洪毅等倡导进行手术治疗，观点是通过手术才能够对远期脊髓功能的恢复情况有积极的影响。由此可见手术与否的选择争议很大。当前大多数学者认为，短期内神经功能无明显恢复或恢复不满意者可有手术指征。手术与否及手术时间的掌握常常困扰着医疗工作人员，对病情发展的准确评估仍是一个较大的难题。所以最好出现一个指标用来协助我们准确地辨别脊髓损伤程度、恢复状况和依据具体损伤来决定诊疗方案，避免病情进一步发展或恶化。

在分辨脊髓损伤程度方面，改良SEP检测优势明显。其潜伏期的存在及时间长短可判定被测试感觉纤维的传导功能，传导功能异常可使潜伏期时间延长。其波幅的大小则代表了受测神经纤维产生同步放电神经元的量的多少。本实验为判定脊髓损伤程度的可信度和脊髓损伤的恢复情况，采用改良SEP检测方法。正常血液中NSE含量极微，约3～8ng/mL[8]。NSE与乳酸脱氢酶、醛缩酶、肌酸激酶不同，它不与细胞内肌动蛋白结合，因而很容易释放出来。国内秦凯[9]在大鼠急性SCI后通过对血浆中NSE的定量分析发现其会明显增高，能够客观的监测脊髓损伤严重情况。经大量实验证明，S-100β

参与神经元损伤病理机制和重塑机制，可体现、反映神经元的完整性。在形态方面因为S-100β分子量小，容易通过屏障，可较易测得。在模型成功后探讨用临床上容易获取的血清，通过对其中NSE及S-100β的测定来揭示大鼠脊髓损伤情况及恢复程度。

本实验研究发现，在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β；一定损伤程度范围内，随着损伤程度的增进，大鼠血清中NSE和S-100β表达有所升高，且与脊髓损伤的程度呈正相关，即：随着程度的不断加大，NSE和S-100β的阳性表达结果逐渐增多；大鼠脊髓损伤后6h的阳性表达量到达最大值，明显高于对照组。可认为NSE和s-100β能够作为检测脊髓损伤严重程度的一个指标，进一步为临床研究方向提供一种新见解。 从本文数据分析，我们可以认为当大鼠血清中NSE含量大于6.26ng/mL时可能出现了脊髓的损伤，这有一定意义存在。NSE和S-100β两者在研究中发现不具有相关性，这还需要我们进一步的探索。

本文实验亦存在不足之处，样本数量不够庞大，实验手法及技巧仍需要加强，同时，鉴于资金等局限因素，未能进行大数据统计，本实验在统计72h组时因样本丢失过大，统计可信性降低，未予以采用，因而还需要以后进行更具代表性的实验验证。

[1]LoyDN,SroufeAE,PeltJL,etal.Serumbiomarkersforexperimentalacutespinalcordinjury:rapidelevationofneuron-specificenolaseandS-100beta[J].Neurosurgy,2005,56(2):391-397

[2]邓晓冬,李跃辉,钟晓.脊柱爆裂性骨折伴脊髓损伤患者围术期血清炎性与神经功能指标的变化[J].海南医学院学报,2014,20(5):670-672,676

[3]YokoboriS,ZhangZ,MoghiebA,etal.Acutediagnosticbio-markersforspinalcordinjury:reviewoftheliteratureandpreliminaryresearchreport[J].WorldNeurosurg,2015,83(5):867-878

[4]KonstantinouEA,VenetsanouK,MitsosAP,etal.NeuronspecificenolaseNSE:avaluableprognosticfactorofcentralnervoussystemdysfunctionfollowingcardiacsurgery[J].BritJAnaesthetRecNur,2008,19:22-28

[5]UndenJ,IngebrigtsenT,RomnerB.Managementofminorheadinjurieswiththehelpofabloodtest.S100-βanalysiscanreducethenumberofCTexaminationsandpatientadmissions[J].Lakartidningen,2008,105(2425):1846-1848

[6]王勇,周成福,鲍靖,等.大鼠急性脊髓损伤时NSE的表达及临床意义[J].黑龙江医药科学,2012,35(4):47-48

[7]宿献伟,周成福,马晓茹.大鼠急性脊髓损伤早期Rab3a的表达[J].黑龙江医药学,2012,35(4):38-39

[8]O'BrienMD.Spinalcordinjury:progress,promiseandpriorities[J].JournaloftheRoyalSocietyofMedicine, 2006, 99(11):585-586

[9]秦凯,周成福,李亚峰.急性脊髓损伤时NSE和ET的表达及临床意义[J].黑龙江医药科学,2009,32(6):11-12

1.2016年佳木斯大学研究生科技创新项目,编号：YM2016_026；2.黑龙江省教育厅科研项目，编号：12531717。

王崇禧(1987～)男,山东沂水人,在读硕士研究生。

周成福(1964～)男，黑龙江佳木斯人,硕士，主任医师,教授，硕士研究生导师。E-mail:3534478470@qq.com。

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