PTEN、PDGF-B及TGF-β1在UUO大鼠肾脏的表达①

朱章龙, 康晓明, 杨占双, 张雅丽

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科,黑龙江 佳木斯 154003)

PTEN、PDGF-B及TGF-β1在UUO大鼠肾脏的表达①

朱章龙, 康晓明, 杨占双, 张雅丽

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科,黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探究磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)、血小板衍化生长因子B(PDGF-B)及转化生长因子β1(TGF-β1)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠与假手术(Sham)大鼠肾间质不同时间点的表达变化及它们的相关性。方法：将48只雄性Wistar大鼠随机分为2组，行单侧输尿管结扎术造成UUO模型，Sham组大鼠假手术处理。在手术后的第3、7、14天分批处死，取左肾石蜡包埋，行HE染色、Masson染色，免疫组化检测各组大鼠上述因子的表达。结果：与Sham组对应时间点相比，UUO模型组肾小管间质损伤和纤维化程度加重，PDGF-B、TGF-β1表达逐渐增多，PTEN表达逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)；PTEN表达与PDGF-B、TGF-β1表达呈显著负相关(P均<0.05)。结论：PTEN参与了肾间质纤维化发病的过程，可能是一种抗肾脏纤维化的内源性保护因子，且PDGF-B、TGF-β1下调PTEN的表达可能是它们发挥促肾间质纤维化作用的部分机制。

PTEN；PDGF-B；肾间质纤维化；转化生长因子-β1

肾间质纤维化(RIF)是在各种细胞因子作用下，间质细胞增殖与凋亡失衡、胞外基质(ECM)过度沉积，逐渐导致正常肾脏结构及功能丧失的病理过程，是导致终末期肾病的主要病理基础。磷酸酶和张力蛋白同源物的基因(phosphataseandtensinhomolog；pten)在促进胚胎发育、维持干细胞功能、细胞增殖和凋亡等生命活动中都起着至关重要的调节作用，被认为是重要性仅次于p53的抑癌基因。近年来，一些研究发现pten表达的PTEN蛋白在特发性肺纤维化、肝脏纤维化、心肌纤维化及心室重构、口腔黏膜下纤维化[1]等纤维化病理改变的疾病中发挥着重要作用，但其对RIF的影响尚不清楚。本研究旨在探讨UUO大鼠模型肾组织中PTEN的表达对RIF的影响以及PDGF-B、TGF-β1与PTEN的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物的分组与模型建立

健康清洁级雄性Wistar大鼠48只，体重140～180g，适应喂养一周后随机分为2组(Sham组、UUO组)。大鼠均腹腔注射10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉后，以俯卧位固定于手术台上，备皮后常规消毒铺巾，在肋腰点，脊柱左侧旁开1cm处切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层，将左侧输尿管结扎后离断。Sham组仅切开腹腔并游离左侧输尿管，但不结扎和剪断。两组大鼠在术后第3、7、14天分批处死8只。处死前一天收集24h尿液。处死当天麻醉后采血，留取左肾置10%中性甲醛固定。

1.2 实验指标检测

将采集的尿液分别进行尿素氮(BUN) 、肌酐(Scr)检测，尿液行尿蛋白定量(24hPro)检测。将肾组织石蜡包埋、切片，分别行常规HE染色和改良Masson染色[2]。参考TaalMW[3]的方法，每张切片随机选10个不含肾小球的视野(×400)，半定量分析肾小管及间质的损伤情况，加权平均为肾小管及间质损伤评分(TLS)，总分0～9分。Masson染色则每例切片随机记录10个连续不重叠的视野(×200)，以蓝染纤维面积与整个视野总面积的百分比作为RIF指数，两组切片分别加权平均得该组的RIF指数，对纤维化程度评估。免疫组化采用SABC法，每次染色均用0.01mol/LPBS代替一抗作为阴性对照。每例切片在(×400)光镜下观察，随机选取10个肾小管及间质区域，利用图像分析系统计算两组肾组织阳性染色(棕黄色颗粒)的平均光密度(AOD)，即积分光密度与视野内肾间质面积比。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠尿液和生化分析

UUO组BUN、Scr、24hPro与Sham组比较，三者浓度随时间逐渐增加，提示UUO组大鼠肾功能受损逐渐加重，差异有统计学意义(P<0.05) ，表明造模成功。见表1。

2.2 两组大鼠肾组织学变化

HE染色显示Sham组各个时间点肾脏在光镜下观察结构正常。UUO组术后3d肾小管扩张，肾间质见少量淋巴细胞浸润；7d近曲小管及远曲小管明显囊性扩张，肾间质大量炎症细胞浸润，偶见肾小管萎缩；14d肾皮髓质萎缩，部分肾小管萎缩，肾小管上皮细胞水肿，部分小管上皮细胞坏死、脱落或消失，间质淋巴细胞浸润和纤维化较前明显；偶见管型。两组对应时间点TLS评分差异存在统计学意义(P<0.05)。Masson染色见UUO组随术后输尿管梗阻时间延长，3d、7d、14d的肾小管变性、坏死逐渐加重，代之以间质纤维，蓝染面积逐渐增多。与Sham组相比，UUO组大鼠肾小管损伤、肾间质炎症和纤维化程度进行性地加重。见表2。

表1 两组大鼠肾功能指标的比较±s，n=8)

两组比较，P<0.05。

表2 两组大鼠TLS评分、RIF指数的比较

注：P<0.05。

2.3 蛋白表达情况

Sham组肾小管上皮细胞胞浆偶可见PDGF、TGF-β1蛋白阳性表达；UUO组肾小管上皮细胞可见PDGF、TGF-β1蛋白表达明显，且随时间进展表达量逐渐增多，与正常组同时间点相比有统计学意义(P<0.05)；与Sham组相比，UUO组大鼠肾小管上皮细胞胞浆的PTEN蛋白表达量随着梗阻时间延长逐渐减少，且PTEN蛋白表达与PDGF-B、TGF-β1蛋白表达呈显著负相关(P均<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肾组织各时间点三种蛋白AOD值±s，×10-2)

注：两组同一时间点比较，▲P<0.05，#r值：PTEN与PDGF-B相关系数；##r值：PTEN与TGF-β1相关系数。

3 讨论

RIF是包括肾小管上皮细胞转分化(EMT)、成纤维细胞增殖与凋亡失常、-ECM分泌与降解失衡等导致的不良修复[4]。PTEN也可称为TGF-β调节的上皮细胞的富含磷酸酶1(TEP1)，由1209个核苷酸编码的403个氨基酸组成，肽链氨基端为双重特异性磷酸酶核心区，即蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)序列和末端的PIP2结合序列，后者能特异性地切割磷脂酰肌醇-3,4,5三磷酸(PIP3)，去磷酸化为磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)。PIP3作为胞内第二信使，能激蛋白激酶B(AKT)和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK1)等多种底物，故PTEN能下调AKT、PDK1来调节下游多条通路的生物效应[5]。PTP序列则能使丝/苏氨酸、酪氨酸残基脱磷酸化。PDGF-B是酪氨酸受体激酶家族的一员，TGF-β1属于丝/苏氨酸蛋白激酶，它们对PI3K/PDK1/AKT等信号通路的激活是纤维化疾病的部分机制。TangWW[6]较早发现将PDGF-B注入大鼠体内，结果诱导了肾小管间质肌成纤维细胞的增生和间质纤维化，并认为肾间质细胞是PDGF在肾脏的主要效应细胞。PDGF-B有两种受体PDGFR-α和PDGF-β，ChenYT[7]用伊马替尼干预实验表明两种PDGFR都激活周细胞、肌成纤维化细胞增殖参与RIF。YilmazO[8]在以PDGFR抑制剂达沙替尼减弱博来霉素诱导的大鼠肺纤维化，发现其逆转肺纤维化作用与上调PTEN的表达来减弱PDGF激活的胞内信号通路有关。LiuZ[9]发现微小RNA21(miR-21)下调PTEN来升高AKT的表达；而使用AKT特异阻滞剂时，能抑制TGF-β1/miR-21诱导的肝细胞纤维化。综上所述，本实验中PTEN表达减弱与肾小管上皮细胞凋亡和EMT增加呈正相关，而与PDGF

-B和TGF-β1蛋白表达呈负相关，故我们推测PDGF-B和TGF-β1的过度表达下调了PTEN的表达，进而减弱PTEN对PI3K/AKT等下游底物的去磷酸化作用，减弱PTEN维持肾小管上皮细胞形态和对成纤维细胞增殖的调控作用。随着PTEN参与纤维化机制的深入研究，有望为RIF的治疗提供新的思路和依据。

[1]AngadiPV,KrishnapillaiR.EvaluationofPTENImmunoexpressioninOralSubmucousFibrosis:RoleinPathogenesisandMalignantTransformation[J].HeadandNeckPathology, 2012, 6(3):314-321

[2]魏胜男, 曾翔俊, 李汇华. 小鼠肾脏纤维化Masson染色方法的改进[J]. 解剖学报, 2013, 44(4):576-579

[3]TaalMW,ZandinejadK,WeeningB,etal.Proinflammatorygeneexpressionandmacrophagerecruitmentintheratremnantkidney.[J].KidneyInternational, 2000, 58(4):1664-1676

[4]李丽, 王长山, 李怀荆,等. 黄芪当归合剂对梗阻性肾病大鼠E-cadherin和α-SMA表达的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2015, 38(6):4-5

[5]张丹, 袁禧先. 抑癌基因PTEN在大肠腺瘤、大肠癌组织中的表达及意义[J]. 黑龙江医药科学, 2008, 31(3):10-11

[6]TangWW,UlichTR,LaceyDL,etal.Platelet-derivedgrowthfactor-BBinducesrenaltubulointerstitialmyofibroblastformationandtubulointerstitialfibrosis[J].AmericanJournalofPathology, 1996, 148(4):1169-1180

[7]ChenYT,ChangFC,WuCF,etal.Platelet-derivedgrowthfactorreceptorsignalingactivatespericyte-myofibroblasttransitioninobstructiveandpost-ischemickidneyfibrosis[J].KidneyInt，2011，80:1170-1181

[8]YilmazO,OztayF,KayalarO.Dasatinibattenuatedbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisinmice[J].GrowthFactors, 2015, 33：5-6

[9]LiuZ,WangJ,GuoC,etal.MicroRNA-21mediatesepithelial-mesenchymaltransitionofhumanhepatocytesviaPTEN/Aktpathway.[J].Biomedicine&Pharmacotherapy, 2015,69:24-28

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：YM2016_057。

朱章龙(1989～)男，广东韶关人，在读硕士研究生。

康晓明(1961～)女,黑龙江佳木斯人,硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail：kanglaoshi@163.com。

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1008-0104(2017)03-0092-02

2017-03-07)