冰冻切片和石蜡切片对免疫组化染色效果的对比分析

方雪松

[摘要] 目的 研究皮肤、肉芽组织采用石蜡切片以及冰冻切片免疫组化的染色效果。方法 2014年8月—2016年8月期间选取Wistar大鼠共60只，双盲法随机分为A、B两组各30只。实验前对60只大鼠进行背部切割伤，脱毛后在每只大鼠背部切割伤部位取1 cm×1 cm大小的皮肤块作为标本，A组大鼠皮肤块标本采用石蜡制片，B组大鼠皮肤块标本采用冰冻制片。对两组大鼠标本切片进行免疫组化染色，观察两组大鼠标本切片染色情况。 结果 B组SP、EGF、EGFR以及FGF强阳性率分别为96.67%、100.00%、96.67%、93.33%，明显高于A组的0.00%（P<0.05）。A1组抗原活性阳性率分别为93.33%、96.67%、93.33%、100.00%。明显高于A2组的13.33%、13.33%、3.33%、6.67%以及A3组的10.00%、16.67%、13.33%、3.33%（P<0.05）。B1组EGF、FGF抗原活性强阳性率分别为100.00%、93.33%，高于B2组的6.67%、3.33%（P<0.05）。结论 冰冻制片免疫组化染色效果更佳，值得临床应用及推广。

[关键词] 皮肤；肉芽组织；冰冻制片；石蜡制片；免疫组化染色

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）05（a）-0016-03

[Abstract] Objective To study the effects of paraffin sections and frozen sections on Immumohistochemical staining in the tissues of skin and granulation. Methods 60 Wistar rats were selected from August 2014 to August 2016 and randomly divided into group A and group B with 30 cases in each group respectively. Before experiment， 60 rats were concis on the back. After removing the hair， the skin with the size of 1 cm×1 cm was taken from cut injuries on the back and served as sample. The specimens of rats in group A were adopted paraffin sections， and rats in B group were adopted frozen sections. Immunohistochemical staining was performed on the two groups of rats to observe the section staining of the rats in two groups. Results The positive rates of SP， EGF， and EGFR in group B 96.67%、100.00%、96.67%、93.33% were significantly higher than those of group A 0.00%（P<0.05）. In group A， the weak positive rates were relatively higher with regard to antigen activity detection for specimens of A2 and A3（93.33%、96.67%、93.33%、100.00% vs 13.33%、13.33%、3.33%、6.67% vs 15.00%、16.67%、13.33%、3.33%）. However， the above mentioned antigen activity detection rates of A1 were significantly higher than those of A2 and A3 with（P<0.05）. In group B， the strong positive rates of B1 group with significantly higher than those of B2 with regard to antigen activity detection of EGF and FGF with（10.00%、93.33% vs 6.67%、3.33%）（P<0.05）. Conclusion The effect of frozen sections is significantly better than that of paraffin sections on immumohistochemical staining， which is worthy of clinical application and popularization.

[Key words] Skin； Granulation Tissue； Frozen Sections； Paraffin Sections； Immunohistochemical Staining

病理組织检查在临床上应用广泛，是众多疾病诊断的金标准。临床上常见的检查手段包括组织石蜡制片检测以及组织冰冻切片检测，两种方法的优劣在临床上众说纷纭，褒贬不一，在临床上也无相关的统一标准，争议性较大[1-2]。因此该文于2014年8月—2016年8月期间对60只大鼠模型进行研究，探讨皮肤和肉芽组织中石蜡切片和冰冻切片免疫组化染色效果的差异，为临床病理组织诊断提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该次选取由武汉大学动物研究所提供的Wistar大鼠60只进行研究，所有大鼠均为雄性。大鼠体重270～320 g之间，平均体重（288.6±10.5）g。将所有大鼠按双盲法分为两组各30只。A组大鼠体重270～316 g，平均体重（288.4±10.2）g。B组大鼠体重270～320 g，平均体重（289.1±10.6）g。两组大鼠上述资料（性别、体重）差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 试剂与材料 采用Leica2235型石蜡切片机以及Leica1950型冰冻切片机，Olympus BX-50显微镜。

1.2.2 实验前准备 所有大鼠在实验前1周进行背部皮肤全层割伤，致伤前2 d采用10% Na2S进行背部脱毛。

1.2.3 石蜡制片 致伤一周后将A组大鼠活杀，取背部皮肤新鲜肉芽组织为标本，4%多聚甲醛固定24 h，之后石蜡包埋、切片，烤箱中常规脱蜡1 h。①蒸馏水配置3% H2O2溶液，将所得标本切片放入H2O2中室温下灭活5 min，使用蒸馏水冲洗3次，2 min/次。②洗涤后采用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液浸泡标本，加热至100℃，时间30 min。冷却后在37℃下加入0.1%胰蛋白酶10 min，蒸馏水再洗涤3次，2 min/次，下接免疫组化染色。该组标本为A1组。③切片经过步骤①处理后直接在37℃下加入0.1%胰蛋白酶10 min，蒸馏水洗涤3次，2 min/次，下接免疫组化染色。该组为A2组。④石蜡切片后直接与B1组行相同处理为A3组。

1.2.4 冰冻切片 致伤1周后将B组大鼠麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取出背部新鲜肉芽组织再行2 h固定，之后放入20%蔗糖溶液中过夜，温度4℃，次日取出行冰冻切片，厚度为25 μm。实验时采用纯甲醇和H2O2配置为0.5%溶液，将切片浸泡溶液中30 min，蒸馏水洗涤3次，2 min/次，再将标本浸泡至0.1% Triton中1 h，蒸馏水洗涤，2 min/次，洗涤两次后接免疫组化染色。该组为B1组。冰冻切片经处理后进行加热修复和酶消化，下接免疫组化染色。该组为B2组。

1.3 观察指标

观察两组切片标本免疫组化阳性情况，对比相同切片经热修复、酶消化与未经热修复、酶消化的结果情况。阳性判断结果分析，以DAB显色最强处颜色程度为准[3]，阴性（-）：完全不着色；弱阳性（+）：着色为淡棕色；阳性（++）：着色为棕色；强阳性（+++）：着色颜色极深。

1.4 统计方法

采用SPSS 18.0统计学软件分析和处理数据，计量资料用（x±s）表示，采用t检验，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

B组SP、EGF、EGFR以及FGF强阳性率明显高于A组（P<0.05）。A组中A2、A3标本抗原活性检测弱阳性率较高且差异无统计学意义（P>0.05）；而A1上述抗原活性阳性率明显高于A2、A3（P<0.05）。B组中B1在EGF、FGF抗原活性检测中强阳性率明显高于B2（P<0.05）。见表1。

3 讨论

病理组织诊断需要进行组织切片，并经过免疫组化染色过程分析，从而对病理情况进行判断。其中步骤复杂繁多，容易受到各种因素的影响[4]。

目前在临床上认为影响组织切片的因素包括[5]：①固定液的种类、温度以及固定时间长短会影响组织抗原性，而固定剂在固定组织时是否形成醛键，导致组织蛋白与蛋白之间发生交联，导致抗原决定簇被破坏，也是影响组织抗原性质的重要因素，可能引起抗原在免疫组化染色中不能与抗原充分结合，导致染色效果不准确。目前在组织免疫组化染色的过程中以尽可能缩短固定时间为原则，避免时间过长导致的影响[6]。研究显示[7]，一般组织最佳固定时间在3～6 h，一般临床上控制在12 h以内。而动物实验则表明[8-9]，采用原位灌注再浸泡固定的方法可取的满意效果。②制片过程中的影響，包括脱水液的种类、温度、时间以及ph值。在传统的石蜡制片中，需要对组织进行反复的二甲苯、酒精等溶剂浸泡处理，在制作切片过程中的高温环境中容易对石蜡切片产生影响，从而对免疫组化染色结果造成一定影响。而冰冻切片技术则有效的避免了上述高温、反复浸泡溶剂等影响，可有效提高免疫组化染色效果[10]。在该文中采用大鼠背部皮肤肉芽组织进行研究，分别使用石蜡制片和冰冻切片，并详细分为酶消化、热修复等处理，结果显示，B组SP、EGF、EGFR以及FGF强阳性率分别为96.67%、100.00%、96.67%、93.33%，明显高于A组的0.00%（P<0.05）。A1组抗原活性阳性率分别为93.33%、96.67%、93.33%、100.00%。明显高于A2组的13.33%、13.33%、3.33%、6.67%以及A3组的10.00%、16.67%、13.33%、3.33%（P<0.05）。B1组EGF、FGF抗原活性强阳性率分别为100.00%、93.33%，高于B2组的6.67%、3.33%（P<0.05）。结果提示采用冰冻制片有效提高了免疫组化染色准确率。而在其他学者的研究中也显示[11]，采用冰冻切片进行免疫组化染色阳性率高达95.00%以上，而石蜡切片免疫组化染色阳性率仅为80.00%，提示冰冻切片组化免疫效果更高，该文结果与之相符。

综上所述，冰冻制片免疫组化染色效果更佳，值得临床应用及推广。

[参考文献]

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（收稿日期：2017-02-05）