自身免疫抗体检测在恶性血液疾病的临床应用研究

钟智强 吴书玲 孙明洪 骆 丰 沈建平

自身免疫抗体检测在恶性血液疾病的临床应用研究

钟智强 吴书玲 孙明洪 骆 丰 沈建平

目的 评价自身免疫抗体检测在恶性血液疾病诊疗中的临床价值。方法 回顾分析2012年1月至2016 年6月453例血液疾病患者外周血ANA、anti-MPO、anti-PR3、AIHA-IgG、PAIg检测结果，采用间接免疫荧光法检测ANA，免疫印记法检测anti-MPO、anti-PR3、PAIg，抗人球蛋白试验检测AIHA-IgG，同时比较外周血细胞计数与自身免疫抗体之间的关联性。结果 MDS和CLL患者自身免疫抗体阳性率高于其它恶性血液疾病，分别占29.7%和27.5%；在所检测自身免疫抗体中ANA阳性率最高，占11.7%，Anti-PR3阳性率最低，占2.6%；自身免疫抗体阳性CLL患者RBC和PLT计数较阴性患者低，而自身免疫抗体阳性MDS患者WBC计数较阴性患者低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 MDS和CLL较其它恶性血液疾病更易并发自身免疫反应，且与患者外周血细胞减少相关，自身免疫性抗体检测有助于加深临床对MDS和CLL的发病机制的认识，帮助临床根据不同患者自身免疫状况采取相应治疗方案。

自身免疫 抗核抗体 抗蛋白酶3抗体 抗髓过氧化物酶抗体 血小板相关抗体

恶性血液疾病是发生在造血干细胞水平的恶性克隆性疾病，可涉及多个细胞系。患者常会出现异常克隆细胞增殖失控与其它系血细胞数量减少共存，自身免疫及炎症反应在其中发挥重要作用。恶性血液疾病类型与自身免疫抗体的关联性还有待研究，本文探讨临床常用自身免疫抗体检测在常见恶性血液疾病外周血细胞减少方面的临床价值。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2012年1月至2016年6月本院血液科就诊的恶性血液疾病患者453例，男230例，女223例；年龄6～81岁，中位年龄47岁。包括急性髓系白血病（AML）82例、慢性髓系白血病（CML）77例、骨髓增生异常综合征（MDS）91例、急性淋巴细胞白血病（ALL）75例、慢性淋巴细胞白血病（CLL）69例、多发性骨髓瘤（MM）59例。病例选择参照《2008年WHO造血与淋巴组织肿瘤分类》各系恶性血液肿瘤发病率为标准，所有患者均为初诊并且就诊前未曾使用影响血细胞数量的药物。本项目经本院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 试剂与设备 EDTA抗凝真空采血管和分离胶促凝真空采血管购自奥地利Greiner Bio-One GmbH公司，抗核抗体（ANA）、抗髓过氧化物酶抗体（anti-MPO）、抗蛋白酶3抗体（anti-PR3）、血小板相关抗体（PAIg）试剂盒购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司，抗人球蛋白试剂购自上海血液生物医药有限公司，间接免疫荧光法采用日本OLMPUS BX51荧光显微镜检测，全血细胞分类计数采用美国Beckman Coulter DXH800血细胞分析仪检测。

1.3 方法 （1）标本处理：所有患者分别用EDTA抗凝管和分离胶促凝管采集外周静脉血5～6ml。抗凝血采集后立即颠倒混匀5次，上机前再颠倒混匀5次，30min内完成全血细胞分类计数检测。促凝血采集后静置20～30min，3000r/min离心10min后分离血清，置于4℃冰箱保存，24h内完成ANA、anti-MPO、anti-PR3、PAIg检测。抗人球蛋白抗体于采血后3h内完成检测。（2）全血细胞分类计数检测：血细胞计数采用COULTER电阻抗原理，白细胞分类采用VCSn原理，每例患者全血标本连续检测3次取平均值，按照本科室SOP文件进行操作，仪器配套质控品显示室内质控满意符合要求。（3）自身免疫抗体检测：ANA检测采用间接免疫荧光法，anti-MOP、anti-PR3、PAIg检测采用免疫印迹法，测定值以定性表示（阴性或阳性），所有操作严格按照试剂盒操作说明书进行，采用试剂盒自带阴性和阳性对照作为室内质量控制。自身免疫性溶血性贫血抗体（AIHA-IgG）采用直接抗人球蛋白试验（DAGT），采用同型健康体检者洗涤红细胞作为阴性对照。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料采用（x±s）表示，组间两两比较采用t检验。计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自身免疫抗体检测结果 在疾病类型方面，MDS和CLL自身免疫抗体阳性人数比例最高，分别为29.7%、27.5%。在所检测自身免疫抗体中ANA阳性率最高，占11.7%，其次是PAIg阳性率6.2%，AIHAIgG阳性率4.0%，anti-MPO阳性率3.8%，Anti-PR3阳性率最低，占2.6%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、2。

表1 不同血液疾病自身免疫抗体阳性率比较

表2 不同类型自身免疫抗体阳性率比较［n（%）］

2.2 CLL患者外周血细胞计数比较 WBC计数在自身免疫抗体阳性与阴性间比较差异无统计学意义（P＞0.05），自身免疫抗体阳性CLL患者RBC和PLT计数较自身免疫抗体阴性患者低（P＜0.05），差异有统计学意义，见表3。

表3 CLL患者自身免疫抗体阳性与阴性外周血细胞计数比较（x±s）

2.3 MDS患者外周血细胞计数比较 自身免疫抗体阳性MDS患者WBC计数比阴性患者低，差异有统计学意义（P＜0.05），而RBC和PLT计数差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 MDS患者自身免疫抗体阳性与阴性外周血细胞计数比较（x±s）

3 讨论

较多恶性血液疾病易并发自身免疫反应，其中抗体介导的自身免疫应答发挥着重要作用，包括常见的自身免疫性血细胞减少、血管炎等，有时甚至成为疾病首发临床表现。本资料显示常见髓系和淋系恶性疾病中均可检出自身免疫性抗体，但总体阳性率并不高，从2.6%～29.7%。MDS是一组克隆性造血干细胞疾病，以髓系血细胞减少或发育异常、无效造血及急性白血病发病风险增高为特征［1］。较多患者出现固有免疫和适应性免疫异常，从而出现自身免疫和炎症反应，据报道其发病率7%～25%［2］。本资料显示MDS患者自身免疫抗体阳性率29.7%，在恶性血液疾病中自身免疫抗体阳性率最高，也高于相关文献报道的发病率，这可能与研究人群构成有关，且MDS是一种强异质性疾病，其发病机制仍未阐明，诊断标准也在不断完善。在自身免疫抗体谱方面MDS患者以ANA为主，占23.1%，与免疫性血细胞减少相关的自身抗体则处于低水平。27例自身免疫抗体阳性患者中有5例血管炎、1例类风湿关节炎、2例过敏性紫癜、1例自身免疫性溶血性贫血，其余无明显自身免疫临床表现。统计分析显示MDS患者外周血RBC和PLT计数与自身免疫抗体阳性与阴性间差异无统计学意义（P＞0.05），针对血细胞膜抗原成分的自身免疫抗体检出率与临床表现并不一致，MDS患者DAGT试验阳性率5.5%高于实际AIHA发病率3.7%，同样PAIg阳性率12.1%也高于实际过敏性紫癜发病率7.4%。虽然MDS存在自身免疫抗体但是出现自身免疫疾病并不常见，且以脉管炎及结缔组织疾病为主要表现，这与抗体谱中阳性率以ANA和ANCA为主相关。然而，统计分析表明MDS患者自身免疫抗体阳性患者外周血WBC计数低于阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。MDS出现血细胞减少是多种因素综合作用的结果，包括免疫下调、炎症因子增加、基因改变等等。MDS患者存在多髓系来源抑制细胞和炎症因子（如IL-10、TGF-β等）升高现象，这些抑制因素直接造成骨髓造血功能下降从而促进了血细胞减少。此外，MDS患者常出现CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞（Treg）异常。Treg细胞是一类调节性免疫细胞，其功能下降或数量减少促使自身免疫反应发生，功能增强或数量增加则削弱机体免疫监视促进肿瘤生成。低风险MDS患者Treg数量减少，高风险MDS患者Treg数量增加且预后不良［3］。本资料显示自身免疫抗体阳性的MDS患者主要以RCUD、RARS、RCMD类型为主，而高风险RAEB类型在自身免疫抗体阴性MDS患者中比例相对增高，这与以往研究结果相符合，表明Treg细胞是部分MDS出现自身免疫反应因素之一。此外，阳性患者常出现多个自身免疫抗体阳性，单独出现较少见。

自身免疫反应也是CLL最常见的并发症，但是CLL不同于MDS，临床通常以自身免疫性血细胞减少为主要表现，其中AIHA最常见，其次是ITP。CLL患者可以仅出现上述一种自身免疫性血细胞减少也可能同时存在多种，甚至出现EVan’s综合征［4］。本资料显示CLL自身免疫抗体阳性率为27.5%，在恶性血液疾病中位于第2位。自身免疫抗体阳性谱中则以ANA、AIHA-IgG和PAIgG为主，分别占15.9%、14.5%和18.8%，其中AIHA-IgG和PAIgG的靶抗原位于血细胞膜，能够引起抗体所介导的免疫应答造成血细胞破坏，其是引起AIHA和ITP的主要机制［5］。19例自身免疫抗体阳性患者中仅11例出现AIHA和/或ITP临床表现，其余8例无明显临床表现，主要以ANA阳性为主，也体现了血液疾病在发病机制上的部分共性。自身免疫抗体阳性CLL患者外周血RBC和PLT计数低于阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.05），表明自身免疫反应是CLL患者血细胞减少的因素之一。对存在自身免疫反应的CLL患者，临床医师可以通过自身免疫性抗体检测对患者进行评估，采取适合的治疗手段［6］。

除CLL和MDS外，其余四种常见恶性血液疾病的自身免疫抗体阳性率处于低水平，其中又以ANA阳性率相对偏高，这与临床基本相符，即这些疾病临床上并发自身免疫疾病几率也较少。自身免疫和炎症反应贯穿于恶性血液疾病发生发展的整个过程，染色体与基因异常、免疫功能失调等都易引起自身免疫抗体产生，特别是MDS和CLL，临床检测自身免疫抗体不仅有助于疾病发病机制的研究，也为临床进行个体化治疗方案决定提供帮助。

［1］ 张之南, 郝玉书, 赵永强. 血液病学. 第二版. 北京: 人民卫生出版社, 2011: 551-555.

［2］ Al Ustwani O, Ford LA, Sait SJ, et al. Myelodysplastic syndromes and autoimmune diseases-case series and review of literature. Leuk Res, 2013, 37(6): 894-899.

［3］ Ofir W, Richard S. autoimmunity and inflammation in myelodysplastic Syndromes. Acta Haematol, 2016, 136(6): 108-117.

［4］ Hodgson K, Ferrer G, Montserrat E, et al. Chronic lymphocytic leukemia and autoimmunity: a systematic review. Haematologica, 2011, 96(5): 752-761.

［5］ Kerry AR, Jennifer A, Woyach. Secondary autoimmune cytopenias in chronic lymphocytic leukemia, 2016, 43(3): 300-310.

［6］ Matthew K, Kanti R. The challenge of treating complex autoimmune cytopenias in chronic lymphocyteic leukemia, 2010, 5(4): 574-575.

Objective To evaluate the clinical signif i cance of autoimmune antibodies in the diagnosis and therapy of hematologic malignancies. Methods During the period of 2011 to 2016，453 patients with hematologic malignancies in Zhejiang provincial TCM hospital were enrolled in this retrospective analysis. The antibodies prof i les were tested for each patients by using immunoblotting and indirect immunof l uorescence. Results The positive rates of MDS and CLL were higher than those of other malignant hematologic diseases，accounting for 29.7%（27/91）and 27.5%（19/69）respectively. Among the detected autoimmune antibodies，ANA positive rate was the highest，accounting for 11.7%（53/453），while positive rate of Anti-PR3 was lowest，accounting for 2.6%（12/453）. RBC and PLT counts in CLL patients with positive antibodies were lower than in those with negative ones，and WBC count in MDS patients with positive antibodies was lower than in those with negative ones. Conclusions Autoimmunity is more frequently observed in CLL and MDS than other malignant hematologic diseases，associated with hemocytopenia. It’s helpful for clinical doctors to deepen the understanding of the pathogenesis of MDS and CLL，and to help clinical treatment according to different patients' immune status to detect the autoimmune antibodies.

Autoimmune ANA anti-PR3 Anti-MPO PA-IgG

310006 浙江中医药大学附属第一医院