Treg MMP-9及uPA mRNA在肺癌中的表达及临床意义

熊 娟 朱 静 张毅敏 冯建国 胡晓云 徐笑红⋆

Treg MMP-9及uPA mRNA在肺癌中的表达及临床意义

熊 娟 朱 静 张毅敏 冯建国 胡晓云 徐笑红⋆

目的 探讨外周血中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞（Treg）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）mRNA表达在非小细胞肺癌（NSCLC）发展中的临床意义及相关性。方法 流式细胞术检测NSCLC患者及正常对照的外周血中Treg细胞的变化，荧光定量PCR检测外周血中MMP-9及uPA mRNA的表达水平，并分析其与临床病理特征的关系。结果 NSCLC患者外周血中Treg细胞、MMP-9及uPA mRNA的阳性表达率均高于正常对照（P＜0.05）。在NSCLC患者中，Treg含量与分化程度、肿块大小、TNM分期、有无脉管癌栓、有无远处转移等有关（P＜0.05），与其它临床病理因素无关（P＞0.05）；外周血MMP-9 及uPA mRNA的阳性表达率均与TNM分期、淋巴结转移及远处转移有关（P＜0.05），此外MMP-9 mRNA的阳性表达率亦与肿块大小、有无脉管癌栓有关（P＜0.05）；通过Spearman相关分析发现，外周血中Treg含量与MMP-9及uPA mRNA的阳性表达率有一定正相关性（r=0.178，P=0.028；r=0.162，P=0.045），且MMP-9与uPA mRNA阳性表达率亦呈正相关性（r=0.309，P=0.001）。结论 Treg细胞、MMP-9及uPA mRNA表达在NSCLC的发生、发展和转移过程中可能起重要作用。

非小细胞肺癌 调节性T细胞 基质金属蛋白酶-9 尿激酶型纤溶酶原激活物

非小细胞肺癌（NSCLC）是对人类健康危害最大的肿瘤之一，患者死亡的首要原因是复发和转移。因此，探寻降低肿瘤复发、转移的原因以提高治疗效果极为重要。调节性T细胞（Treg）是人体免疫抑制性T细胞，少量存在于正常人体内，主要起抑制免疫细胞活性过高而导致自身免疫性疾病。据报道，肿瘤细胞内存在大量的Treg细胞［1］，其存在可能利于肿瘤细胞的生长增殖及浸润转移。研究表明，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）能有效降解细胞外基质，利于肿瘤细胞通过部分缺失的细胞外基质进一步向周围组织浸润，与恶性肿瘤的浸润和转移密切相关［2-3］。作者通过联合检测NSCLC患者外周血中Treg，MMP-9和uPA mRNA含量，探讨其变化在肺癌发生、发展中的意义，并比较Treg细胞与肺癌转移相关因子表达的相关性。

1 临床资料

1.1 一般资料 2012年1月至2015年6月本院治疗非小细胞肺癌（NSCLC）患者153例为观察组，其中男103例，女50例；年龄36～83岁，平均年龄59.94岁。所有患者均经病理检查确诊，首次血液标本获得时均未行手术、放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗，未曾使用免疫治疗，且均无心、脑、肝、肾等器质性疾病；另选择同期本院体检的健康者40例为对照组，其中男24例，女16例；年龄34～79岁，平均年龄57.58岁。所有标本获得均经过本院伦理委员会批准并征得患者知情同意。

1.2 方法 （1）仪器与材料：PC5标记的鼠抗人CD4抗体、PE标记的鼠抗人C127抗体、FITC标记的鼠抗人CD25抗体及同型对照均购自美国贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter公司）；CytomicsTMFC500型流式细胞仪为Beckman Coulter公司生产。RNA提取液Trizol为美国Invitrogen公司，逆转录采用大连宝生物TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit，荧光定量PCR试剂为江苏硕世生物科技的核酸检测试剂盒，PCR仪为美国ABI7500型荧光定量PCR仪。（2）流式细胞仪检测：所有被观察对象均采集空腹静脉血2ml，经EDTA-K2抗凝，使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞仪分析。操作步骤如下：取单克隆抗体CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE及同型对照各20μl，加入抗凝全血100μl，室温下避光孵育20min，再加入红细胞裂解液500μl，避光孵育10min；加入PBS液漂洗2次，离心弃上清液后加入适量的PBS液，混匀后上机检测。Cellquest软件分析数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异性对照值，以CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+T细胞的百分比表示Treg细胞含量。（3）荧光定量PCR检测MMP9 及uPA mRNA表达： 取EDTA-K2抗凝的外周血3～5ml，加入淋巴细胞分离液分离单个核细胞PBMC，用1ml Trizol试剂进行总RNA的提取；各组取1μg总RNA，70℃预变性5min，按TaKaRa逆转录试剂盒进行cDNA的合成，然后进行PCR检测，扩增条件设置为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，60℃退火、延伸35s，进行40个循环后选择FAM通道进行荧光检测，分析图像。每次扩增均使用相应的标准品5μl进行倍比稀释，制备标准曲线，范围为102～106拷贝/ml。根据标准曲线，仪器自动计算出标本中MMP-9及uPA mRNA的拷贝数，以浓度＞500拷贝/ml设为阳性，浓度＜500拷贝/ml为阴性。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，组间比较用t检验和LSD检验；计数资料的组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC患者外周血Treg细胞表达 153例肺癌患者CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+T细胞的比例为（7.02±2.31）%，正常对照组为（4.53±0.86）%，NSCLC患者与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 NSCLC患者与正常对照中MMP-9、uPA mRNA表达比较 MMP-9 mRNA表达阳性者在NSCLC患者外周血中为40例（26.1%），正常对照中2例（5%），与对照组比较，阳性表达率差异有统计学意义（χ2=10.520，P=0.001）；uPA mRNA表达阳性者在NSCLC中为34例（22.2%），正常对照1例（2.5%），两者的阳性表达率差异有统计学意义（χ2=8.308，P=0.004）。

2.3 Treg细胞、MMP-9 mRNA及uPA mRNA表达与临床病理参数的关系 见表1。

表1 Treg细胞、MMP9 mRNA及uPA mRNA表达与肺癌临床病理参数的关系

2.4 外周血Treg细胞与MMP-9、uPA mRNA表达的相关性 外周血Treg细胞与MMP-9 mRNA表达（r=0.178，P=0.028）及uPA mRNA表达（r=0.162，P=0.045）具有一定正相关，且MMP-9与uPA mRNA表达亦呈正相关性（r=0.309，P=0.001）。

3 讨论

肿瘤的发生是肿瘤细胞生长及侵袭能力由弱到强的过程，而这一过程与机体的免疫功能密切相关。调节性T细胞Treg是近年发现的一种在肿瘤免疫耐受中发挥重要作用的调节细胞，正常人外周血中含量极少，而在肿瘤患者外周血已发现存在大量的Treg细胞［4］，提示Treg细胞是机体参与肿瘤发生免疫应答抑制的细胞之一。关于Treg细胞早期的研究多集中在CD4+CD25+Treg细胞，而CD4、CD25在人体内缺乏特异性，Foxp3是一种叉头状/翼状螺旋转录因子基因编码的蛋白，是Treg细胞成熟和功能的标志［5］。但Foxp3表达于细胞核，必须破膜才能将其染色，且此过程会造成细胞死亡，无法用于进一步临床研究，近年来有研究报道CD127（IL-7受体）与Foxp3的表达呈负相关［6］，CD4+CD25+CD127-等同于CD4+CD25+Foxp3+。

本资料显示，非小细胞肺癌NSCLC患者和健康体检者外周血Treg细胞占CD4+细胞的比例差异有统计学意义（P＜0.05）。在患者组中，根据性别、年龄、吸烟史、病理组织学分类进行比较，发现与该因素均无显著相关性（P＞0.05）。Ⅲ期、Ⅳ期患者Treg细胞均显著高于Ⅰ期与Ⅱ期患者，Ⅳ期患者亦显著高于Ⅲ期患者；此外肺癌的分化程度越低，肿块越大，术后病理检出脉管癌栓，发生远处转移等因素在Treg细胞比例间均有显著差异（P＜0.05）。但本资料显示，Treg细胞在两组不同淋巴结转移状态的NSCLC患者外周血中的比较差异无统计学意义（P＞0.05），这与Curiel等［7］学者研究结果类似。通过对病理因素的分析，在一定程度上表明随着肺癌病程的进展，Treg细胞数量逐渐增多，抑制免疫效应细胞应答，患者抗肿瘤免疫减弱，有利于肿瘤的生长和转移［8］。

肿瘤细胞的浸润和转移依赖于各种蛋白质水解系统的协同作用，其中，MMP-9和uPA发挥了重要作用。MMP-9及uPA是降解细胞外基质最重要的酶类之一，是迄今为止发现的与肿瘤侵袭和转移关系最密切的一类蛋白水解酶。本资料结果显示肺癌外周血中MMP-9 及uPA mRNA表达明显高于正常对照组，且其表达与肺癌的分期有一定关系，分期越差，表达率越高，提示其参与NSCLC的发展和转移。MMP-9 mRNA或uPA mRNA表达阳性的患者，发生淋巴结转移或远处转移的情况更为常见，这可能由于晚期病变中肿瘤细胞进入血液循环相对较多，增加了循环中肿瘤负荷，从而增加了检出率。Sun Q等［2］认为血清MMPs能够用于预测肿瘤患者淋巴结转移情况和预后；Beyer BC等［3］在胃癌的研究中发现uPA高活性与肿瘤浸润深度和腹膜转移密切相关，未分化癌uPA活力高于分化性癌，浸润性生长者表达比膨胀性生长者高。此外本资料中MMP-9 mRNA表达亦与肿瘤体积的大小及脉管癌栓的存在与否密切相关。

MMP9能降解基底膜和细胞外基质，使组织结构发生重塑并诱导肿瘤新生血管形成而导致肿瘤的发生、发展、侵袭和转移［9］；而uPA作为一种丝氨酸蛋白水解酶，可将细胞外基质中的纤维蛋白及纤维结合素等催化降解，进而将基质中的Ⅲ型胶原降解，为肿瘤细胞的侵袭及转移创造了有利的条件［10］。根据相关资料，肿瘤细胞的分期、分化及转移的过程十分复杂，可能是Treg细胞通过调控转移相关因子抑制物的平衡，进一步激活基质降解的一系列反应，使肿瘤细胞穿透性增强，更利于肿瘤浸润、转移［11］。另有研究表明uPA可以激活MMP-9，开启MMP-9对细胞外基质的降解机制，uPA通过细胞外信号通路酪氨酸的激活，与整合素β1结合，激活pro-MMP-9，从而调节MMP-9的活性［12］。

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Objective To investigate the clinical signif i cance of CD4+CD25+CD127-regulatory T cells（Treg）、matrix met alloproteinases-9（MMP-9）mRNA and urokinase plasminogen activator（uPA）mRNA in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）. Method The percentages of Treg were measured by fl ow cytometry，the mRNA expression of MMP-9 and uPA were measured by realtime fl uorescence quantitative PCR；and their relationship with the clinical characteristics of patients with NSCLC were analyzed. Results The frequency of Treg in peripheral blood，the positive rates of MMP-9 and uPA mRNA expression in NSCLC were signif i cantly higher than those in normal control（P＜0.05）. The proportion of Treg cells in peripheral blood of NSCLC was related with tumor differentiation，tumor size，TNM stage，vascular tumor thrombus and distant place metastasis（P＜0.05），but did not correlate to another clinicopathologic features（P＞0.05）；on the other hand，the positive rates of MMP-9 and uPA mRNA expression in NSCLC had a signif i cant impact on TNM stage，lymph node metastasis and distant place metastasis（P＜0.05），while the positive rates of MMP-9 mRNA expression were also affected by tumor size and vascular tumor thrombus（P＜0.05）. By spearman correlation analysis，there was positive correlation between the proportion of Treg cells in peripheral blood and that of MMP9 and uPA mRNA expression（r=0.178，P=0.028；r=0.162，P=0.045），in addition，the positive rates of MMP-9 and uPA mRNA expression were positively correlation（r=0.309，P=0.001）.Conclusion The proportion of Treg cells，MMP-9 and uPA mRNA expression in peripheral blood may play important roles in genesis，development and metastasis of NSCLC.

Non-small cell lung cancer Regulatory T cells MMP-9 uPA

浙江省医药卫生科技项目（2016KYA044）

310022 浙江省肿瘤医院

*通信作者