CD26分子在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞表达的差异分析

辛宇 Melia BogariZin Mar Aung 陈伟 柴岗 张艳

·基础研究·

CD26分子在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞表达的差异分析

辛宇 Melia BogariZin Mar Aung 陈伟 柴岗 张艳

目的 探究CD26表面分子在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达的差异。方法 正常皮肤成纤维细胞（NFs）组的正常皮肤组织取自接受腹部整形术的10例患者；瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）组瘢痕疙瘩组织取自此前未经过任何治疗的10例瘢痕疙瘩患者的胸部和腹部。利用酶消化法获得原代KFs和NFs，应用流式分析技术检测CD26表面分子在2组细胞中的表达差异。用流式分选技术对NFs和KFs组中CD26表达阳性（CD26+）与表达阴性（CD26-）细胞进行分选，体外常规培养4 d后对细胞形态进行初步分析。结果 CD26表面分子在KFs和NFs中均可表达，但KFs组表达率（46.65±13.97）%明显高于NFs组（24.75±16.85）%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。经流式分选后，CD26+与CD26-细胞群在NFs与KFs组中形态均无明显差异。结论 CD26分子在瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中的表达率明显高于正常皮肤组织成纤维细胞中的表达率，CD26-和CK26+细胞群在形态上无明显差异。

CD26分子；成纤维细胞；瘢痕疙瘩；正常皮肤；流式细胞术

目前，瘢痕疙瘩治疗中的高复发率和治疗的复杂性仍是临床面对的棘手问题[1-3]。尽管瘢痕疙瘩的发病机制尚不清楚，大多数病因理论认为其与成纤维细胞功能障碍相关[4]。因此，将治疗方向转向细胞学水平有可能为临床治疗带来全新的视角，并且为进一步深入分析疾病分子学病理机制奠定基础。自2016年1～7月，上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科以流式分析技术为基础，研究CD26分子在瘢痕疙瘩中成纤维细胞的表达情况，为进一步的功能学研究做好基础，并为在细胞学水平治疗瘢痕疙瘩疾病提供新思路。

1 对象和方法

1.1 实验主要试剂和仪器

0.2 %复合胶原酶NB4（SERVA Electrophoresis-GmbH，德国）；0.2%中性蛋白酶（Roche，德国）；磷酸盐缓冲液、0.25%胰蛋白酶（上海思吉生物制品有限公司）；胎牛血清（FBSGibco，美国）；DMEM高糖培养液（Gibco，美国）；FITC anti-human CD26（BioLegend，美国）。

FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国），恒温CO2培养箱（Forma Scientific，美国）；普通台式离心（Heraeus，美国）；倒置相差显微镜（Olympus，日本）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；10 cm培养皿、50 ml离心管、15 ml离心管、200目尼龙滤网（Falcon，美国）。

1.2 方法

1.2.1 标本取材及实验分组 正常皮肤成纤维细胞（normal skin fibroblasts,NFs）组正常皮肤组织取自接受腹部整形术且无瘢痕疙瘩病史和家族史的10例患者，其中男性3例，女性7例；年龄30～50岁。瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts,KFs）组10例瘢痕疙瘩组织取自瘢痕疙瘩切除术获得的胸部和腹部瘢痕疙瘩组织，其中男性4例，女性6例；年龄25～45岁。本实验经过上海市第九人民医院伦理委员会批准，NFs组和KFs组中所有患者在试验前均签署了知情同意书。

1.2.2 KFs组入选及排除标准 KFs组入选标准：⑴符合瘢痕疙瘩疾病的临床诊断标准。①病损范围超过原病灶范围；②病变组织质硬、发红，表面光滑且高于正常皮肤组织；③存在痛、痒等刺激症状。⑵年龄为18～65岁，性别不限。⑶病变发生部位为躯干。⑷病程小于2年，尚处于疾病急性期。⑸患者充分理解并且签署知情同意书。KFs组排除标准：⑴之前接受过任何形式的瘢痕疙瘩治疗。⑵病灶区内有溃疡现象。

1.2.3 细胞获取方法 瘢痕疙瘩标本以氯霉素冲洗液冲洗3遍，PBS充分振荡洗涤3遍，去除血渍及其他组织碎片；无菌条件下去除表皮及皮下脂肪组织，将获得的瘢痕疙瘩真皮部分剪至2 mm×2 mm，PBS振荡洗涤1遍，用0.2%复合胶原酶NB4以37℃恒温振荡消化，5～8 h收获真皮层细胞。消化产物以200目尼龙筛过滤，细胞悬液以1500 r/min离心5 min，弃去上清液。加入PBS振荡混匀，1500 r/min离心5 min，弃去上清液，接种于含10%FBS的DMEM的培养皿，并置于37℃恒温混合气体（5%CO2和95%O2）环境中进行原代培养，每隔3 d换液1次。

正常皮肤组织标本以氯霉素冲洗液冲洗3遍，PBS充分振荡洗涤3遍，去除血渍及其他组织碎片；无菌条件下去除皮下组织，并剪至2 mm×3 mm组织块，PBS振荡洗涤1遍；加入0.2%中性蛋白酶4℃消化过夜，PBS清洗、终止消化，并轻轻揭去表皮层。余下的真皮组织用无菌剪刀剪成l mm×l mm组织块，用0.2%复合胶原酶NB4以37℃恒温振荡消化，4～6 h收获真皮层细胞。消化产物以200目尼龙筛过滤，细胞悬液1500 r/min离心5 min，弃上清。加入PBS振荡混匀，1500 r/min离心5 min，弃上清，接种于含10%FBS的DMEM培养皿，并置于37℃恒温混合气体（5%CO2，和95%O2）环境中进行原代培养，每隔3 d换液1次。

1.2.4 流式分析 原代成纤维细胞生长至80%融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化，离心，重悬浓度为1×104/μl的细胞悬液。10μl抗人CD26试剂加入到100μl细胞悬液中，充分混匀，室温下避光孵育20～30 min，同时在NFs和KFs组内分别设置阴性对照组，除不加10μl抗人CD26试剂外，均与组内实验组经过相同处理。随后样本经流式分析仪在488 nm激光下检测绿色荧光发射。经流式分选后NFs和KFs组细胞均可分为CD26表达阴性（CD26-）和CD26表达阳性（CD26+）细胞群。

1.2.5 细胞形态学观察 分选后将两组CD26-/+细胞接种于含10%FBS的DMEM培养皿，并置于37℃恒温混合气体（5%CO2，和 95%O2）环境中进行连续培养，4 d后在倒置相差显微镜下观察细胞形态和密度，比较两组细胞差异。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。计量数据以±s表示，组间比较采用非配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD26表达率流式分析结果

在NFs和KFs组内的阴性对照组中，细胞阴性率均大于98%，证明在无CD26抗体孵育时细胞基本无荧光表达。CD26在NFs组中表达率为（24.75±16.85）%，在 KFs组中表达率为（46.65±13.97）%，两组差异具有统计学意义（P＜0.01），见图1。

2.2 细胞形态学分析

两组中CD26-和CD26+成纤维细胞均呈现成纤维细胞的纺锤形，细胞大小及密度均匀，在细胞形态和细胞密度上基本一致，未呈现明显差异（图2）。

3 讨论

成纤维细胞作为皮肤组织中支撑结构和分泌基质的主要功能细胞，长期以来被视为单一的功能细胞群体，而其多样性研究鲜有报道。近年来，已有实验利用移植和系谱示踪技术证明，真皮组织中的成纤维细胞是分别来自于上、下真皮层的两个功能不同的细胞系。在正常生理状态下，包含有真皮乳头层的上层真皮层细胞系成纤维细胞可以调节毛发生长和立毛肌功能，而包含有网织层真皮成纤维细胞的下层真皮层细胞则合成大量的细胞外基质和脂肪细胞前体细胞以及真皮脂肪细胞[5]。在皮肤损伤过程中，两种来源细胞也不相同，在损伤修复的最初阶段，是由下层真皮成纤维细胞发动，当进入上皮再生阶段，上层成纤维细胞才会参与修复过程。Rinkevich等[6]利用非选择性损耗的荧光活性细胞分类方法在小鼠动物模型中分选出了胚胎期表达基因Engrailed-1（En1）成纤维细胞系，证明了该细胞系在正常组织细胞外基质的分泌以及在创伤、放射和癌症模型的纤维化相关过程中均起主要作用。最后，利用表面分子筛查技术，最终确定了CD26分子可作为区分En1+和En1-细胞系的表面标记物。CD26分子作为一种广谱表达在哺乳动物细胞表面的二肽酶，在免疫系统激活和调节机制中起到重要作用，在多种皮肤相关疾病中也被证实有CD26 分子上调[7]。

图1 NFs和KFs组CD26分子表达率流式分析结果（B3代表CD26-细胞，B4代表CD26+细胞，因本实验加入的是单标抗体，故B1，B2无实际意义） a.NFs组阴性对照 b.NFs组加入抗人CD26试剂 c.KFs组阴性对照 d.KFs组加入抗人CD26试剂

图2 NFs和KFs组CD26-/+成纤维细胞体外培养4 d后形态学观察 a.NFs组CD26-（×40） b.NFs组CD26+（×40） c.KFs组 CD26-（×40） d.KFs组 CD26+（×40） e.NFs组 CD26-（×100） f.NFs组 CD26+（×100） g.KFs组 CD26-（×100） h.KFs组 CD26+（×100）

CD26是一种在大多数哺乳动物细胞中表达的Ⅱ型跨膜糖蛋白，可以从多肽或蛋白N端释放二肽，在人体中可以表达在多种细胞表面，包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及激活的免疫细胞表面[8]。CD26主要与免疫系统的调节机制相关。此外，免疫系统中T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞都有其表达，该分子也是免疫系统相关细胞激活的表面标志物。CD26在免疫系统调控细胞分化和增殖方面起到关键作用[9-10]。在皮肤组织中，CD26在人体不同起源的角质细胞中对于DNA合成以及细胞增殖起到了极为重要的作用，此外，其还可以结合纤连蛋白在调节细胞与细胞外基质间相互作用发挥重要作用[11]，在一些损伤诱发的皮肤肿瘤和疾病中，其表皮细胞和真皮细胞都存在有明显的CD26分子的上调[7,12]。

瘢痕疙瘩由于仅发生于人体，至今尚无理想的动物疾病模型，而目前关于该疾病的病理学机制仍存在争议，因此，从细胞学水平探究疾病发生机制，并且直接以细胞为功能单位寻找治疗方案，可能为瘢痕疙瘩临床治疗带来全新的视角。同时，瘢痕疙瘩作为一种良性皮肤疾病，其特殊侵袭性与恶性肿瘤疾病有相似表现，已有相关研究证实该疾病与免疫机制失调有关[13]，而CD26分子表达与肿瘤细胞的侵袭力增加有关[14-16]。在瘢痕疙瘩中成纤维细胞作为主要的免疫应答细胞，其侵袭力也高于一般的成纤维细胞[2]。

据此我们推测，在瘢痕疙瘩中的成纤维细胞，其功能异常表现可能与CD26分子表达有关。本研究中以正常皮肤的成纤维细胞作为NFs组，以瘢痕疙瘩组织中的成纤维细胞作为KFs组，初步探索了CD26在2组细胞中表达的差异，而在KFs组中的CD26低表达也指示瘢痕疙瘩组织CD26+细胞群在功能上与细胞的高侵袭性有关。进一步实验中，本课题组将继续探索CD26+细胞群在该疾病纤维化相关功能以及细胞侵袭能力中的作用，并且希望通过应用CD26分子特异性抑制剂对细胞功能起到抑制作用。若能在细胞学水平证实CD26+成纤维细胞系在瘢痕疙瘩疾病中的作用及其机制，将有助于进一步解释该疾病的发病机制，并且为疾病的临床治疗奠定基础。

［1］Butler PD,Longaker MT,Yang GP.Current progress in keloid research and treatment[J].J AmColl Surg,2008,206(4):731-741.

［2］Muthusubramaniam L,Zaitseva T,Paukshto M,et al.Effect of collagen nanotopography on keloid fibroblast proliferation and matrixsynthesis:implications for dermal wound healing[J].Tissue Eng Part A,2014,20(19-20):2728-2736.

［3］Atiyeh BS.Nonsurgical management of hypertrophic scars:evidence-based therapies,standard practices,and emerging methods[J].Aesthetic Plast Surg,2007,31(5):468-492;discussion 93-94.

［4］季江,吴文雅,经晶,等.瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常人皮肤成纤维细胞增殖和胶原产生及相关基因的表达[J].中华医学美学美容杂志,2015,21(6):361-364.

［5］Driskell RR,Lichtenberger BM,Hoste E,et al.Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair[J].Nature,2013,504(7479):277-281.

［6］RinkevichY,WalmsleyGG,HuMS,etal.Skinfibrosis.Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential[J].Science,2015,348(6232):aaa2151.

［7］Arwert EN,Mentink RA,Driskell RR,et al.Upregulation of CD26 expression in epithelial cells and stromal cells during wound-induced skin tumour formation[J].Oncogene,2012,31(8):992-1000.

［8］Ohnuma K,DangNH,MorimotoC.Revisitingan old acquaintance:CD26 and its molecular mechanisms in T cell function[J].Trends Immunol,2008,29(6):295-301.

［9］KimSW,ChoEH.HighlevelsofserumDPP-4activityare associated with lowbone mineral densityin obese postmenopausal women[J].Endocrinol Metab(Seoul),2016,31(1):93-99.

［10］Lu HY,Huang CY,Shih CM,et al.A potential contribution of dipeptidylpeptidase-4 bythe mediation ofmonocyte differentiation in the development and progression of abdominal aortic aneurysms[J].J Vasc Surg,2016 Nov22.

［11］Zilleβen P,Celner J,Kretschmann A,et al.Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4(DPP4)in primary human(pre)adipocytes[J].Sci Rep,2016 Mar 17.

［12］Beckenkamp A,Willig JB,Santana DB,et al.Differential expression and enzymatic activityofDPPIV/CD26 affects migration ability of cervical carcinoma cells[J].PloS One,2015,10(7):e0134305.

［13］Al-Attar A,Mess S,Thomassen JM,et al.Keloid pathogenesis and treatment[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(1):286-300.

［14］Kikkawa F,Kajiyama H,Shibata K,et al.Dipeptidyl peptidaseⅣin tumor progression[J].Biochim Biophys Acta,2005,1751(1):45-51.

［15］Sato T,Yamochi T,Yamochi T,et al.CD26 regulates p38 mitogen-activated protein kinase-dependent phosphorylation of integrin beta1,adhesion to extracellular matrix,and tumorigenicity of T-anaplastic large cell lymphoma Karpas 299[J].Cancer Res,2005,65(15):6950-6956.

［16］Pethiyagoda CL,Welch DR,Fleming TP.Dipeptidyl peptidase IV(DPPIV)inhibits cellular invasion of melanoma cells[J].Clin Exp Metastasis,2000,18(5):391-400

Analysis of expression of the CD26 marker on keloid fibroblasts

XIN Yu,Melia Bogari,Zin Mar Aung,CHEN Wei,CHAI Gang,ZHANG Yan.(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo analyze the expression of the CD26 marker on normal skin fibroblasts(NFs)and keloid fibroblasts(KFs).MethodsNormal skin tissues in the NFs group were obtained from individuals who underwent abdominal plastic resection.Keloid tissues in the breast and abdomen were harvested in surgery from patients who did not receive any treatment for their keloids.Then NFs and KFs were obtained through the enzyme digestion method.Flow cytometry technology was used to analyze the expression of the CD26 marker on NFs and KFs,and isolate the CD26 positive expressed (CD26+)and CD26 negative expressed(CD26-)cell population of NFs and KFs.Then the cell morphology of CD26-/+fibroblasts were observed after 4 days in vitro culture by inverted microscope.ResultsThe CD26 marker was expressed in both KFs and NFs.KFs exhibited a higher expression rate of CD26(46.65±13.97)%than NFs with that of(24.75±16.85)%(P＜0.01).Observation of cell morphology after 4 days in vitro culture exhibited similar shape and cell density between CD26-cell population and CD26+cell population in both the NFs and KFs groups.ConclusionKFs exhibited a higher expression rate of CD26 than NFs,while the CD26-and CD26+cell population in both the NFs and KFs groups showed similar morphological characteristics.

CD26 marker;Fibroblasts;Keloid;Normal skin;Flowcytometrytechnology

CHAI Gang,Email:13918218178@163.com;ZHANG Yan,Email:13651817522@163.com

2016-11-30）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.011.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.011

国家自然科学基金面上项目（81372097）；上海市科学技术委员会科研计划项目（14441900800，14441900802）；上海交通大学“医工交叉研究基金”（YG2014MS06）；上海交通大学医学院高峰高原计划研究型医师（20161420）

上海交通大学医学院附属第九人民医院 整复外科，上海200011

柴岗，Email:13918218178@163.com；

张艳，Email:13651817522@163.com

本文引用格式：辛宇,Bogari M,AungZM,等.CD26分子在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞表达的差异分析[J].中国美容整形外科杂志,2017,28(1):39-42.