线粒体分裂相关蛋白高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生

魏骐骄 刘晓雅 武国红 吴海荣 朱赛楠 管 娜

线粒体分裂相关蛋白高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生

魏骐骄1刘晓雅1武国红1吴海荣2朱赛楠3管 娜1

目的：探讨肾小球线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、P-Drp1(Ser616)和线粒体分裂蛋白1(Fis1)表达与足细胞损伤及蛋白尿发生的关系。 方法：建立阿霉素大鼠肾病模型，用免疫组化和western blot检测肾小球和肾皮质Drp1、P-Drp1(Ser616)及Fis1的表达，分析上述蛋白表达与蛋白尿及足细胞线粒体形态的相关性。在小鼠足细胞系MPC5过表达Drp1，分析对凋亡和线粒体形态的影响。 结果：肾小球和肾皮质Drp1在阿霉素大鼠肾病模型4周和6周时表达增强，肾小球P-Drp1(Ser616)在6周时表达增强，肾小球Fis1在2周和6周时增强。肾小球和肾皮质Drp1、肾小球P-Drp1(Ser616)和Fis1表达与24h尿蛋白正相关。肾小球Drp1表达量与足细胞线粒体胞浆密度和线粒体细胞密度呈负相关。肾小球P-Drp1(Ser616)与足细胞线粒体最大长宽比呈负相关。肾小球Fis1与足细胞线粒体面积和周长呈负相关。过表达Drp1致小鼠足细胞凋亡显著增多，线粒体片段化。 结论：肾小球Drp1、P-Drp1(Ser616)与Fis1高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生，Drp1高表达致线粒体片段化和足细胞凋亡。

蛋白尿 足细胞 线粒体分裂 线粒体动力相关蛋白1 线粒体分裂蛋白1

肾病综合征(NS)大量蛋白尿的发生主要由足细胞损伤所致。足细胞损伤机制目前尚未充分阐明[1-2]。近年在线粒体基因突变相关的NS[3-4]、塌陷型局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者[5]及大鼠模型[6]中发现受损足细胞存在大量异形线粒体。我们也在阿霉素大鼠肾病模型发现受损足细胞线粒体形态紊乱、大小不一，在模型早期密度一过性增多，后期线粒体膜表面积密度减少[7]；且发现线粒体片段化现象参与阿霉素诱导小鼠足细胞凋亡过程伴线粒体膜电位下降[8]。线粒体形态受线粒体动力学调控，即线粒体不断融合和分裂，处于动态平衡。线粒体片段化现象主要受线粒体分裂相关蛋白包括线粒体动力相关蛋白1(Drp1)和线粒体分裂蛋白1(Fis1)的调控[9]，其中Drp1促分裂功能受磷酸化调控[10]。Drp1及Fis1异常均可促进线粒体过度分裂从而诱发细胞凋亡[11-12]。本研究提出线粒体分裂相关蛋白异常可能通过促线粒体过度分裂参与足细胞损伤和蛋白尿发生的假说并加以探讨。

材料与方法

阿霉素大鼠肾病模型的建立 本研究在已建立的阿霉素大鼠肾病模型上进行[7]，经北京大学第一医院实验动物伦理委员会批准。选取体重120～160g雄性Sprague Dawley大鼠随机分成阿霉素组(n=16)和对照组(n=14)。在阿霉素注射后2、4和6周测定24h尿蛋白并留取肾组织，具体方法参考文献[7]。

肾小球促线粒体分裂蛋白表达分析 肾组织常规制备石蜡切片，采用二步法免疫组化染色。一抗为兔源Drp1单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，兔源P-Drp1(Ser616)单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)和兔源Fis1多克隆抗体(美国Thermo Fisher Scientific公司)。二抗为兔超敏二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥公司)。用光学显微镜(Olympus)镜检并采集图像，每例随机拍摄15个肾小球，用Image pro-plus(6.0版)软件分析肾小球内阳性染色的平均光密度(average optical density，AOD)及阳性染色面积占肾小球面积比(area ratio，AR)作为各蛋白表达量的半定量值。

肾皮质促线粒体分裂蛋白表达分析 采用常规Western blot方法[13]。所用Drp1和Fis1抗体同免疫组化中抗体。以GAPDH为内参，采用图像分析系统进行半定量分析。每例大鼠取3次肾皮质进行独立实验，以3次数据均值作为每例的半定量数据。

促线粒体分裂蛋白与足细胞线粒体形态指标相关性分析 我们前期已报道了该模型的线粒体体视学数据[7]，本文探讨促线粒体分裂蛋白表达量与足细胞线粒体面积、周长、最大长宽比、线粒体在足细胞或足细胞胞质中的面数密度等指标的相关性。

促线粒体分裂蛋白与足细胞特异分子免疫荧光染色双重标记 对6周阿霉素大鼠肾病模型肾组织冰冻切片进行免疫荧光染色。一抗同免疫组化染色所用抗体，分别与足细胞标记分子synaptopodin鼠源单克隆抗体(Novus Biologicals,USA)进行双重染色。二抗为羊抗兔IgG/Alexa Fluor 488和羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor 594(北京中杉金桥)。用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus Fluoview FV 1000)镜检取图。

小鼠足细胞系培养、转染及凋亡和线粒体形态检测 采用小鼠MPC5足细胞系(美国Peter Mundel教授赠送)。培养方法参考以往报道[14]。当细胞密度约80% 时，用GV230-EGFP-Dnm1L 和GV230-EGFP 质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司)转染。用TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche，USA)检测凋亡，重复4次独立实验，选取至少60个转染阳性细胞分析。用Mitotracker标记线粒体，激光扫描共聚焦显微镜镜检。

统计分析 采用SPSS 22.0版统计软件，结果以中位数±四分位间距(Median±Q)或均数±标准差(Mean±SD)表示。两组组间比较选用Mann-Whitney U检验或独立样本t检验(student’s t-test)，P<0.05被认为具有统计学意义。采用Pearson相关性分析分析各蛋白表达与蛋白尿及线粒体形态指标的相关性。

结 果

阿霉素大鼠肾病模型 参见以往报道[7]，与对照组比较，阿霉素组大鼠尿蛋白在4周(150.5±87.7 mgvs16.0±9.2 mg，P=0.013)和6周增多(226.9±106.9 mgvs12.0±4.4 mg，P<0.010)。

免疫组化染色肾小球各分子表达与蛋白尿的相关性

Drp1与蛋白尿 对照组大鼠Drp1沿肾小球毛细血管袢(GCW)呈细颗粒状少量分布。2周时，阿霉素组大鼠肾小球Drp1较对照组无显著改变，4周和6周时表达显著增多，分布不均，在部分GCW呈团块状聚集(表1)。Drp1的AOD值(r=0.48，P=0.01)和AR值(r=0.43，P=0.02)与24h尿蛋白定量呈正相关。

P-Drp1(Ser616)与蛋白尿 对照组大鼠P-Drp1(Ser616)沿GCW少量分布。阿霉素组大鼠肾小球P-Drp1(Ser616)在2周和4周时类似对照组，6周时表达显著增强，在肾小球均匀弥漫分布(表1)。P-Drp1(Ser616)的AOD值(r=0.52，P<0.01)和AR值(r=0.44，P=0.02)与24h尿蛋白定量呈正相关。

Fis1与蛋白尿 对照组大鼠Fis1沿GCW呈粗颗粒状分布。阿霉素组大鼠肾小球Fis1在2周时AOD和AR值显著增高；4周时类似对照组；6周时 Fis1表达显著增强，分布不均，在部分GCW有粗大颗粒状聚集(表1)。Fis1的AOD值(r=0.51，P<0.01)和AR值(r=0.66，P<0.01)与24h尿蛋白定量呈正相关。

表1 阿霉素大鼠肾小球线粒体分裂相关蛋白免疫组化染色半定量分析

AOD：平均光密度值；AR：阳性染色面积占肾小球面积比。所有数据以中位数±四分位间距(Median±Q)表示，Mann-Whitney U检验，统计量为Z值；以下统计值均与同时间点对照组相比：a：Z=-2.384，P=0.017；b：Z=-2.353，P=0.019；c：Z=-2.785，P=0.005；d：Z=-2.98，P=0.003；e：Z=-2.664，P=0.008；f：Z=-2.546，P=0.011；g：Z=-2.087，P=0.037；h：Z=-3.138，P=0.002；i：Z=-3.2，P=0.001

阿霉素大鼠肾病模型肾皮质Drp1与Fis1的表达及与蛋白尿相关性 Western blot分析显示，与对照组比较，阿霉素组大鼠肾皮质Drp1在2周时无显著变化，4周(0.414±0.091vs0.032±0.017，P<0.01，n=3)和6周(0.390±0.184vs0.154±0.187，P<0.05，n=3)时显著增多(图1)。Drp1表达量与24h尿蛋白定量呈正相关(r=0.47，P<0.01)。阿霉素组大鼠Fis1无显著改变(图1)。

图1 阿霉素大鼠肾病模型肾皮质Drp1和Fis1的表达Western Blot方法检测显示，与对照组相比，阿霉素组大鼠肾皮质Drp1在4周(P<0.01)和6周(P<0.05)时显著增多；各个时间点阿霉素组大鼠肾皮质Fis1无显著改变；A：2周对照组；B：2周阿霉素组；C：4周对照组；D：4周阿霉素组；E：6周对照组；F：6周阿霉素组

促线粒体分裂蛋白与足细胞线粒体形态相关性 免疫组化染色显示的肾小球Drp1的AR值分别与足细胞线粒体胞质密度(r=-0.44，P=0.02)和细胞密度(r=-0.40，P=0.03)呈负相关，P-Drp1(Ser616)的AR值与线粒体最大长宽比(r=-0.37，P=0.03)呈负相关，Fis1的AOD值与线粒体面积(r=-0.43，P=0.02)和周长(r=-0.49，P=0.01)呈负相关。肾皮质Drp1表达量分别与线粒体胞质密度(r=-0.46，P=0.01)、细胞密度(r=-0.48，P<0.01)及最大长宽比(r=-0.49，P=0.01)呈负相关。

促线粒体分裂相关蛋白与足细胞分子共定位分析 免疫荧光染色显示，正常肾小球仅有微弱Drp1、P-Drp1(Ser616)和Fis1染色，阿霉素组大鼠肾小球高表达的Drp1、P-Drp1(Ser616)和Fis1与足细胞特征性分子synaptopodin存在共定位关系(图2)。

图2 阿霉素肾病大鼠肾小球促线粒体分裂蛋白与synaptopodin免疫荧光染色双标记A、B和C：促线粒体分裂蛋白Drp1、P-Drp1(Ser616)和Fis1分别与snaptopodin免疫荧光染色双标记，Synaptopodin标记为红色，促线粒体分裂蛋白标记为绿色；阿霉素组大鼠Drp1，P-Drp1(Ser616)和Fis1在肾小球与足细胞分子synaptopodin存在共定位(IF，×600)

小鼠足细胞系过表达Drp1对凋亡和线粒体形态的影响 与空质粒组比较，Drp1过表达组足细胞凋亡显著增多(31.23%±10.41%vs5.74%±4.03%，P=0.004)。对照组线粒体呈长杆状，Drp1过表达组线粒体变短、小，呈片段化现象(图3)。

图3 小鼠足细胞MPC5过表达Drp1后凋亡分析及线粒体形态DAPI：4，6-联脒-2苯基吲哚；GFP：绿色荧光蛋白；Mitotracker:线粒体荧光探针；A、B：采用TUNEL方法，与空质粒对照组比较，过表达Drp1组足细胞凋亡显著增多，#:P<0.01；C:用Mitotracker(红色)标记线粒体，与空质粒对照组比较，足细胞过表达Drp1后线粒体变短、小，呈片段化现象(IF，×1 000)

讨 论

足细胞是影响蛋白尿发生的关键细胞，其损伤机制尚未阐明[2]。我们前期[7-8]及Li等[15]、王慧等[16]发现线粒体片段化现象参与阿霉素、嘌呤霉素及醛固酮诱导的足细胞损伤机制。线粒体片段化主要由线粒体过度分裂所致，被认为是凋亡前兆，可致凋亡促发因子从线粒体释放诱导凋亡[9-12]。对足细胞线粒体片段化机制的进一步阐明有助于发现新的足细胞保护靶点。

Drp1和Fis1是调控线粒体分裂的关键蛋白。Drp1主要位于胞质，在线粒体分裂时被募集至线粒体外膜，与线粒体外膜的Fis1相互作用使线粒体分裂[9]。Drp1促线粒体分裂功能主要受2个磷酸化位点包括丝氨酸637位与616位的调控[10,17]，其中P-Drp1(Ser616)促进线粒体分裂，而P-Drp1(Ser637)作用相反。本研究探讨促线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1参与足细胞损伤及蛋白尿发生的假说。

我们发现，大鼠肾小球Drp1和Fis1主要沿肾小球毛细血管袢分布，与足细胞特征性分子synaptopodin存在共定位，显示其定位足细胞，并通过免疫组化染色和肾皮质western blot方法证实在大鼠肾病模型蛋白尿发生发展过程中肾小球Drp1和Fis1表达显著增多，且与24h尿蛋白定量呈正相关，表明Drp1和Fis1高表达参与足细胞损伤和蛋白尿发生，且发现P-Drp1(Ser616)增多也参与足细胞损伤和蛋白尿发生。上述现象尚未见其他报道。Ayanga等[18]曾发现足细胞特异性Drp1基因敲除小鼠糖尿病肾病模型较野生型足细胞线粒体片段化现象和蛋白尿明显改善；Wang等[19]报道小鼠Drp1 Ser600磷酸化后增强了Drp1促线粒体分裂作用，介导了高糖所致足细胞损伤。王慧等[16]发现在醛固酮诱导肾损伤小鼠模型肾皮质Drp1表达上调。本研究所用阿霉素大鼠肾病模型为原发NS模型，结果提示Drp1和Fis1高表达可能参与原发性NS蛋白尿发生机制。

本研究通过相关分析探讨了Drp1和Fis1高表达是否可能通过促线粒体分裂参与足细胞损伤。线粒体片段化时主要表现为变短、变小、最大长宽比变小[20]。线粒体密度在线粒体发生片段化早期可能一过性增多，随着线粒体清除增多可能会减少[21]。我们发现，肾小球和肾皮质Drp1量均与足细胞线粒体密度呈负相关，肾皮质Drp1和肾小球P-Drp1(Ser616)表达量与线粒体最大长宽比呈负相关，肾小球Fis1表达量与线粒体面积和周长呈负相关，提示Drp1和Fis1高表达可能与足细胞线粒体过度分裂和清除有关。进而，本研究在小鼠足细胞系过表达Drp1，证实Drp1高表达导致足细胞线粒体片段化和足细胞凋亡显著增多。

总之，本研究揭示了肾小球促线粒体分裂蛋白Drp1高表达和P-Drp1(Ser616)增多以及Fis1高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生，证实足细胞Drp1高表达可导致线粒体片段化和足细胞凋亡。目前在其他疾病已研发了多种Drp1拮抗药物[22-24]，对上述损伤路径的深入探讨有助于探索新的足细胞保护策略。

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(本文编辑 青 松 加 则)

Mitochondrial fission proteins are involved in proteinuria in adriamycin-induced rat nephropathy

WEIQijiao1,LIUXiaoya1,WUGuohong1,WUHairong2,ZHUSainan3,GUANNa1

1DepartmentofPediatrics,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China2DepartmentofCentralLaboratory,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China3DepartmentofBiostatistics,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China

GUANNa(E-mail：guanna@163.com)

Objective：To investigate the glomerular expression of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 in adriamycin (ADR) induced nephropathy rats and their relationship with podocyte injury. Methodology：ADR rat nephropathy was established. Glomerular expressions of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 were investigated by immunohistochemistry. Renal cortical expressions of Drp1 and Fis1 were evaluated by western blot. Correlation analysis was performed to analyze the correlations between mitochondrial fission proteins, proteinuria and mitochondrial morphology. Drp1 overexpression was performed on mouse podocyte cell line, mitochondrial morphology and apoptosis were evaluated. Results：Glomerular expression of Drp1 increased at 4 and 6 weeks. Glomerular P-Drp1 (Ser616) increased at 6 weeks by immunohistochemistry. Glomerular Fis1 increased at 2 and 6 weeks by immunohistochemistry. Glomerular expressions of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 were negatively correlated with 24-hour proteinuria positively. Glomerular expression of Drp1 was negatively correlated with mitochondria density in podocytes. Glomerular expression of P-Drp1 (Ser616) was negatively correlated with mitochondria aspect ratio, and glomerular Fis1 was correlated with mitochondria area and circumference negatively. Drp1 overexpression led to podocyte apoptosis and mitochondrial fragmentation in MPC5. Conclusion：Overexpressions of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 participated in ADR nephropathy. Overexpression of Drp1 led to mitochondrial fragmentation and podocyte apoptosis.

proteinuria podocyte mitochondrial fission dynamin-related protein 1 mitochondrial fission protein 1

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.01.007

国家自然科学基金(81570639，81100502)，教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-12-0006)

1北京大学第一医院儿科(北京，100034)，2中心实验室，3医学统计室

管 娜(E-mail:guanna@163.com)

2016-10-13

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