大黄酚对脑缺血/再灌注小鼠脑组织NO的影响和断头抗缺氧作用

王四海，梁春利，张海红，王树△

大黄酚对脑缺血/再灌注小鼠脑组织NO的影响和断头抗缺氧作用

王四海1，梁春利1，张海红2，王树2△

目的研究大黄酚（Chry）对小鼠脑缺血/再灌注损伤后脑组织内NO的影响及其断头抗缺氧作用。方法将75只SPF级昆明种小鼠随机分为假手术组、模型组、大黄酚高剂量组（Chry 10.0 mg/kg）、中剂量组（Chry 1.0 mg/kg）、低剂量组（Chry 0.1 mg/kg）。采用改良Himori法制作小鼠脑缺血/再灌注损伤模型，根据Bederson评分标准测定小鼠神经功能损伤评分。对各组小鼠进行断头抗缺氧实验，记录小鼠喘息时间，并测定脑组织内NO的含量。结果与模型组比较，大黄酚低、中、高剂量组脑缺血再灌注后神经功能损伤评分和脑组织NO含量明显降低，断头抗缺氧的喘息时间（s）明显延长［低剂量组，14.6±1.2；中剂量组，16.4±1.2；高剂量组，17.4±1.1；与模型组（13.2±1.0）比较，均P＜0.05］。结论大黄酚可通过减少脑内NO含量和抗缺氧作用对脑缺血/再灌注损伤起到保护效应。

大黄酚；脑缺血；再灌注损伤；一氧化氮；抗缺氧；Himori法

大黄酚（chrysophanol，Chry）是大黄中游离型蒽醌类成分之一，具有广泛的生物活性，如抗心肌缺血、改善脂肪代谢、抗炎、利尿、抗癌、止咳和神经保护作用等。本课题组前期研究证实，在小鼠脑缺血/再灌注损伤引起的记忆功能障碍中，大黄酚呈现出明显的神经保护效应［1］。另有研究显示，脑缺血小鼠由于亚硝酸钠（NaNO2）中毒可导致耐缺氧能力减弱，而大黄酚能提高小鼠脑组织的耐缺氧能力，明显延长小鼠存活时间［2］。一氧化氮（NO）在脑缺血/再灌注损伤中的作用机制十分复杂，既可以缓解组织缺血、保护神经细胞受到损伤，又可诱导细胞凋亡发挥神经细胞毒性作用［3-4］。目前有关大黄酚对脑组织中NO的影响及其断头抗缺氧作用尚少见报道。本实验通过改良后的Himori法制作小鼠脑缺血/再灌注损伤实验模型，研究大黄酚对脑组织中NO的影响及其断头抗缺氧作用，为临床治疗脑血管疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器 大黄酚购自中国药品生物制品检定所（批号 110796-200412，纯度≥98%），按照 N，N-二甲基甲酰胺∶聚山梨酯-80∶生理盐水为1∶1∶8的比例配制溶剂，溶解大黄酚，用生理盐水稀释至质量浓度（W/V）为0.1%、0.01%、0.001%备用。NO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。LabTech全自动紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）；FSH-2内切式组织可调高速匀浆器（江苏大地自动化仪器厂）；二列六孔电热恒温水浴锅（北京精科华瑞仪器有限公司）；Sigma3K30高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Forma-86c ULT冰柜（-80℃，美国热电公司）。

1.1.2 实验动物与分组 75只昆明种小鼠，SPF级，雌雄不限，体质量（28±2）g，许可证编号：SYXK（京）2009-0004，购自中国医学科学院药物研究所。采用随机数字表法将小鼠分为5组（n=15）：假手术组正常手术，但不进行脑缺血/再灌注操作；模型组和大黄酚低、中、高剂量组均进行脑缺血/再灌注操作，大黄酚低、中、高剂量组分别于缺血前30 min腹腔注射大黄酚0.1、1.0、10.0 mg/kg；假手术组和模型组分别在缺血前30 min腹腔注射配制溶剂10 mL/kg。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脑缺血/再灌注损伤模型的制备 通过改良Himori法［5］造模。腹腔注射 3.5%水合氯醛（10 mL/kg）麻醉小鼠后，以仰卧位形式固定，在颈部正中纵向切开约6 mm切口，找出两侧颈总动脉并进行分离，用黑色手术线（手术线提前用液体石蜡浸泡）穿过两侧的颈总动脉，尽量将两侧颈总动脉恢复到原位，而后轻柔地将黑色手术线打成松的反手结（在气管上方），反手结的松紧程度不应压迫气管。在两侧颈总动脉的上方黑线上，穿过1条白色手术线（手术线提前用液体石蜡浸泡），根据Himori方法埋好线后将切口缝合。在手术后48 h，拉紧颈下部黑色手术线，使得两侧颈总动脉阻断，造成大脑缺血，5 min后慢而轻地拉两侧的白色手术线，在颈总动脉中恢复血液再灌注。

根据Bederson评分标准对各组小鼠神经功能损伤情况进行评分：0分，无神经损伤；1分，悬尾试验不能完全伸展对侧前爪；2分，前肢抵抗对侧推力下降；3分，向对侧转圈。

1.2.2 断头抗缺氧实验和脑组织内NO含量的测定 假手术组正常手术，但不作脑缺血/再灌注操作；模型组和大黄酚组均在手术后的48 h将血流阻断5 min，血供恢复后10 min将小鼠快速断头处死［6］，观察小鼠张口喘息情况，以5 s内不再张口喘息作为观察指标，记录小鼠喘息时间。

在冰块生理盐水上将颅骨快速打开，取出脑，将脑膜及小脑除去，大脑部分保留，用4℃生理盐水冲洗后，用小滤纸片吸干，放置在1 mL离心管中，然后置于Forma-86C ULT冰柜中进行冷冻贮存。当进行实验时，把冷冻的脑组织取出并制成体积分数为10%的脑组织匀浆，以3 500～4 000 r/min于低温离心机（-4℃）进行离心，10 min后取出离心管，将适量上清液取出，以NO试剂盒测定脑组织内NO含量。组织匀浆中NO含量（μmol/L）=［（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）］×标准管浓度（20 μmol/L）。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑缺血/再灌注后小鼠神经功能损伤评分 模型组小鼠脑缺血/再灌注后神经功能损伤严重，其神经功能损伤评分（2.90±0.32）明显高于假手术组（0.10±0.02），大黄酚低、中、高剂量组神经功能损伤评分［分别为（2.40±0.70）、（1.89±0.60）、（1.36±0.50）］均低于模型组，差异有统计学意义（F=82.31，n=15，P＜0.05）。

2.2 大黄酚对小鼠脑缺血/再灌注断头后抗缺氧的喘息时间影响 与假手术组比较，模型组小鼠脑缺血/再灌注断头后抗缺氧的喘息时间显著缩短（P＜0.05）；与模型组比较，大黄酚低、中、高剂量组小鼠脑缺血/再灌注断头后抗缺氧的喘息时间显著增加（均 P＜0.05），见表 1。

2.3 大黄酚对小鼠脑缺血/再灌注脑组织中NO含量的影响 与假手术组比较，模型组小鼠脑组织中NO含量显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，大黄酚低、中、高剂量组小鼠脑缺血/再灌注脑组织中NO含量显著减少（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Effects of chrysophanol on NO in brain tissue and gasping time after cerebral ischemia-reperfusion in mice表1 大黄酚对小鼠脑缺血/再灌注断头后抗缺氧的喘息时间及脑组织中NO含量的影响 （n=15，±s）

Tab.1 Effects of chrysophanol on NO in brain tissue and gasping time after cerebral ischemia-reperfusion in mice表1 大黄酚对小鼠脑缺血/再灌注断头后抗缺氧的喘息时间及脑组织中NO含量的影响 （n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05

假手术组模型组大黄酚低剂量组大黄酚中剂量组大黄酚高剂量组F 20.6±1.7 13.2±1.0a14.6±1.2b16.4±1.2b17.4±1.1b43.26＊＊2.5±1.4 5.5±3.0a4.0±1.5b1.5±0.9b2.2±1.5b94.23＊＊

3 讨论

本研究结果表明，脑缺血/再灌注模型小鼠脑组织中NO含量显著增加，这与文献报道相一致［3-4］，在脑缺血/再灌注损伤中，当神经元产生的NO持续增加，产生过氧化硝基物和过氧化阴离子导致神经毒性，可造成神经细胞的损伤。另外，本研究结果显示，与模型组比较，大黄酚低、中、高剂量组小鼠脑缺血/再灌注脑组织中NO含量显著减少，提示大黄酚对小鼠脑缺血/再灌注脑组织中NO含量呈现出显著的抑制效应。氧自由基（oxygen free radical，OFR）生成增多和脂质过氧化的发生是脑缺血/再灌注损伤发病的重要机制，氧自由基的生成对血脑屏障造成很大损伤，加速脑水肿形成、引起血管内皮黏附分子（VECAM）的表达以及血小板和白细胞与内皮的黏附，使得脑缺血/再灌注后脑部的微血管循环障碍加重；同时，随着脑缺血/再灌注的发展，自由基剧烈增多，导致生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使细胞膜结构发生损伤，引起细胞膜功能障碍［7］。因此抗自由基损伤是防治脑缺血/再灌注损伤的重要机制之一。NO是自由基损伤的主要标志物之一。由此提示大黄酚可减少脑中NO的含量，清除缺血/再灌注损伤小鼠脑中的自由基，保护大脑功能，是其保护脑缺血/再灌注损伤的重要机制之一。

本研究中断头抗缺氧实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠断头后抗缺氧的喘息时间显著缩短；与模型组比较，大黄酚可明显延长脑缺血/再灌注小鼠抗缺氧的喘息时间，提示小鼠脑缺血/再灌注后急性抗缺氧能力降低，大黄酚能显著提高小鼠急性抗缺氧的能力。有研究报道，苯肾上腺素（phenylephrine）可诱导豚鼠胸主动脉环血管发生收缩反应，而大黄酚能抑制该收缩效应，呈剂量依赖性；另外，大黄酚还可抑制组胺和氯化钾诱导的血管收缩效应，分别可降低最大收缩力19.2%和18.8%，表明大黄酚有舒血管的效应，能使血流量增加，从而提高血氧水平［8］。结合本研究，给予小鼠大黄酚后，小鼠的抗缺氧能力明显增高，提示大黄酚通过舒张小鼠的血管，增加了血流量和血中的氧含量，从而增强了小鼠的抗缺氧能力。由此可推测，大黄酚对脑缺血/再灌注损伤的保护作用与其扩张血管作用有关，详实机制有待进一步研究。

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（2017-01-18收稿 2017-04-12修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Effects of chrysophanol on NO of brain tissue and anti-anoxia in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury

WANG Si-hai1,LIANG Chun-li1,ZHANG Hai-hong2,WANG Shu2△
1 Department of Cardiothoracic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Hebei North University,Xuanhua 075100,China;2 Department of Pharmacy,Hebei North University△

E-mail:wangshu388@163.com

ObjectiveTo study the effects of chrysophanol（Chry）on NO of brain tissue and anti-anoxia in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsA total of 75 SPF Kunming mice were randomly allocated into five groups:sham operation group,ischemia-reperfusion group,high-dose group(Chry 10.0 mg·kg-1),medium-dose group(Chry 1.0 mg·kg-1)and low-dose group(Chry 0.1 mg·kg-1).Using improved Himori method,cerebral ischemia reperfusion-injury model was produced in conscious mice by temporarily obstructing bilateral common carotid arteries.The neurological function was measured according to the Bederson scoring standard.The mice were subjected to decapitation for hypoxia tolerance test.The gasping time was measured by anoxia tolerance test in beheaded mice.The level of NO in cerebrum was detected.ResultsChrysophanol can decrease the level of NO in cerebrum of mice with cerebral ischemia-reperfusion injury and prolong the gasping time in beheaded mice with cerebral ischemia-reperfusion injury[low-dose group,(14.6±1.2)s;medium-dose group,(16.4±1.2)s;high-dose group,(17.4±1.1)s;ischemia-reperfusion group,(13.2±1.0)s,P＜0.05].ConclusionThe protective effects of chrysophanol on cerebral ischemia-reperfusion injury are involved in decreasing the content of NO in brain tissue and anti-anoxia in mice.

Chrysophanol;brain ischemia;reperfusion injury;nitric oxide;anti-anoxia;Himori method

R285.5

：A

10.11958/20170078

河北省科技支撑计划项目（07276166）；河北北方学院自然科学研究项目（2010022）

1河北北方学院第二附属医院心胸外科（邮编075100）；2河北北方学院药学系

王四海（1970），男，硕士研究生，副主任医师，主要从事多器官损伤保护研究

△通讯作者 E-mail：wangshu388@163.com