兔口腔黏膜上皮细胞与PCL电纺纤维的复合尿道支架的制备及可行性分析

关勇，孟庆娅，徐国栋，张富义，舒剑波

兔口腔黏膜上皮细胞与PCL电纺纤维的复合尿道支架的制备及可行性分析

关勇，孟庆娅，徐国栋，张富义，舒剑波

目的探讨兔口腔黏膜上皮细胞与聚己内酯（PCL）电纺纤维的复合支架用于尿道修复的可行性。方法用三氯甲烷和无水甲醇体积比5∶1的混合液配制25%PCL混合液，通过静电纺丝得到PCL纤维管状支架，在其管腔内种植1.5×105个兔口腔黏膜上皮细胞，然后埋入裸鼠皮下，2周后取出，通过HE和细胞角蛋白抗体免疫荧光染色对该复合尿道支架进行生物学评价。未种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL管为对照组，其评价方法同上。结果与对照组比较，种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL管展现出良好的细胞化，并且兔口腔黏膜上皮细胞在PCL管腔表面形成了一层致密的细胞层，兔口腔黏膜上皮细胞能够在PCL管腔表面存活增殖。结论兔口腔黏膜上皮细胞可以作为组织工程化尿道支架的种子细胞来源之一，其与PCL电纺纤维相结合，可以构建适合于尿道修复需要的组织工程替代材料。

口腔黏膜；上皮细胞；组织工程；聚己内酯；尿道支架；静电纺丝

尿道损伤、狭窄或缺损主要由于外伤或肿瘤、先天畸形、炎症等所致，需要进行相应的修复与重建，长段狭窄或大面积的缺损往往需要替代材料，临床上常因缺乏理想的材料或替代选择不当导致重建手术遇到困难，甚至失败，因而尿道修复重建成为泌尿外科、儿科和整形外科面临的难题［1］。随着组织工程技术的快速发展，可降解高分子材料逐渐成为尿道修复材料的研究热点［2］。聚己内酯［Poly（εcaprolactone），PCL］是由 ε-己内酯开环聚合所得到的线性脂肪族聚酯，具有良好的生物降解性、力学性能、药物通过性［3］，但PCL缺乏生物活性。口腔黏膜上皮细胞因与尿道黏膜细胞同属上皮组织中的被覆上皮，在尿液环境中有向尿路上皮转化的潜能［4］，并且有取材方便、创伤小、上皮细胞层厚、组织韧性强、抗感染能力较强等优点，成为理想的尿道修复种子细胞［5］。本研究以PCL为材料，通过静电纺丝制备PCL纤维尿道支架，与兔口腔黏膜细胞相结合，构建种子细胞与可降解高分子材料复合的尿道支架，并对其细胞浸润、血管形成以及兔口腔黏膜上皮细胞的增殖情况进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。清洁级（CL）雄性裸鼠8只，体质量20～25 g，购自北京军事医学科学院实验动物中心；兔口腔黏膜上皮细胞，购自齐氏生物科技公司。（2）主要试剂及仪器。PCL颗粒（数均分子量为80 000）和MTT购自美国Sigma公司；三氯甲烷和无水甲醇购自天津化学试剂六厂；一抗：细胞角蛋白抗体（Rabbit Anti-Cytokeratin 19），工作浓度 1∶100，购自武汉博士德公司；二抗：Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG，工作浓度为 1∶200，购自Invitrogen。扫描电子显微镜（SEM，型号QUANTA 200，美国FEI公司），高级正置荧光显微镜（型号Axio Imager Z1，德国ZEISS公司），正置显微镜（型号Leica DM3000，德国Leica公司），多功能酶标仪（美国PerkinElmer LLC）。

1.2 PCL纤维支架的制备 将PCL颗粒溶于三氯甲烷和无水甲醇（体积比为5∶1）的混合溶液中制成250 g/L的PCL电纺液。将PCL电纺液倒入10 mL的注射器内，注射器顶端为21 G不锈钢针头。针头与高压电源的输出端相连，接收器为旋转的不锈钢棒，直径为2.5 mm（用于尿道管支架）和15 cm（用于纺膜），喷射速度8 mL/h，发射器与接收器的距离为15 cm，电压为14 kV。制备尿道管支架的纺丝时间为4 min，制备膜支架的纺丝时间为30 min。将制得的PCL支架置于真空干燥箱内干燥48 h后备用。将得到的PCL尿道管支架喷金处理后，通过扫描电镜观察其横截面及内腔纤维排布情况。

1.3 细胞相容性检测 将PCL电纺膜裁成直径为1 cm的圆片，正面朝上放入48孔板中，用直径为9 mm的塑料环固定PCL膜片。经75%乙醇浸泡、紫外线杀菌后，取出固定塑料环并铺入5.0×103个兔口腔黏膜上皮细胞，37℃细胞培养箱中进行培养，每24 h更换培养液1次。分别在第1、3、5天时间点终止细胞生长，MTT细胞增殖实验试剂盒测定细胞的增殖情况。具体步骤如下：在既定时间点每孔加入MTT反应液 100 μL、37℃反应 4 h，加入 300 μL DMSO 37℃摇床震动15 min，每孔反应液吸取50 μL放入96孔酶标板中测定光密度（OD）550值。

1.4 兔口腔黏膜上皮细胞与PCL复合尿道管支架的制备 将PCL尿道管裁成长度为1.5 cm的圆柱。经75%乙醇浸泡30 min灭菌，超净工作台中晾干后，沿管腔壁均匀铺入1.5×105个（每管）兔口腔黏膜上皮细胞，37℃细胞培养箱中静置培养1 h后，加入一定量的培养基没过PCL尿道管，37℃细胞培养箱中培养12 h后，即可得到兔口腔黏膜上皮细胞与PCL复合尿道管支架。本研究以没有种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL纤维尿道管作为对照组。

1.5 复合尿道支架裸鼠皮下埋植及生物学评价 裸鼠腹腔注射水合氯醛（7.2 mg/kg），待充分麻醉后将其放置到实验台，背部朝上，固定四肢和头部，碘伏消毒，75%乙醇脱碘后，以脊柱为中线，在两侧对称位置用眼科剪剪出宽为1 cm的开口，用平头剪刀将裸鼠皮肤与结缔组织分离，将种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL尿道管支架从开口处植入裸鼠皮下，脊柱左右各1根。对照组埋植方式同上。共皮下埋植8只裸鼠，每组4只。

2周后，将裸鼠安乐死，取出皮下埋植的兔口腔黏膜上皮细胞与PCL复合尿道管支架和空白PCL管，小心剔除周围多余的组织，经4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水，OCT包埋后，进行冰冻切片，切片厚度为6 μm，通过HE染色及CK19抗体免疫荧光对复合尿道支架的性能进行生物学评价。

2 结果

2.1 PCL尿道支架形态特征 通过实验室自制的静电纺丝设备制备的PCL尿道管，扫描电子显微镜观察发现该PCL尿道管的形态保持良好，壁厚在500 μm左右，具有疏松多孔的结构，有利于细胞浸润，内腔表面纤维分布均匀，见图1。

Fig.1 The structure of electrospinning PCL urethral scaffold materials图1 电纺PCL尿道支架材料结构图

2.2 PCL电纺纤维可促进兔口腔黏膜上皮细胞增殖 第 1、3、5天细胞 MTT OD550值分别为 0.16±0.03、0.29±0.01、0.39±0.02，即随时间延长，PCL 电纺膜表面细胞MTT OD值逐渐增加。

2.3 兔口腔黏膜上皮细胞与PCL复合尿道细胞浸润显著 HE染色结果显示，种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL尿道管的细胞浸润要显著好于对照组，且其内腔有一层连续致密的细胞层，见图2。免疫荧光染色结果显示复合管内腔表面的连续致密的细胞为兔口腔黏膜上皮细胞，见图3。兔口腔黏膜上皮细胞可以在PCL尿道管上存活和增殖，且有利于细胞向PCL尿道管的浸润。

3 讨论

创伤、感染引起的尿道狭窄是临床上较为常见的泌尿系统疾病［6］。尿道狭窄段切除端端吻合术主要用于治疗狭窄段小于2 cm的尿道狭窄，当狭窄段长于2 cm时，临床上主要利用舌黏膜、颊黏膜及结肠黏膜等代替物进行尿道修复，但术后易发生并发症，手术成功率降低［7-9］。组织工程研究的进展为尿道损伤的修复开辟了新的道路。刘春晓等［10］采用单纯多孔丝素蛋白支架修复1.5 cm的新西兰大白兔尿道缺损，术后16周，尿道上皮细胞和平滑肌细胞排列有序，与正常对照组无明显差别，但是由于丝素蛋白吸收速度较快，在尿道完全修复前就已被吸收，会导致修复段尿道的挛缩。而PCL体内降解速度缓慢，可与其他高分子材料共聚，实现可控降解，且PCL具有良好的力学性能和生物相容性。Wang等［11］研究证实粗丝大孔的PCL静电纺丝支架有利于M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转变，促进组织再生。周哲等［3］证明人永生化尿路上皮细胞系（SVHUC-1）能在PCL与丝素蛋白共聚物纤维上较好地生长，说明PCL具备应用于尿道修复的潜能。

Fig.2 The HE staining results of PCL urethral tube that implanted rabbit oral mucosal epithelial cells and control group after two weeks of implantation图2 皮下埋植2周后种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL尿道管和对照组的HE染色结果

Fig.3 The CK19 antibody immunofluorescence staining of PCL urethral tube implanted rabbit oral mucosal epithelial cells and control group after two weeks of implantation图3 皮下埋植2周后种植兔口腔黏膜上皮细胞的PCL尿道管和对照组的CK19抗体免疫荧光染色结果

单纯的生物材料代替物缺少生物活性，术后可能会引起憩室、尿瘘、狭窄复发等一系列严重的并发症，而种子细胞的加入，将会在很大程度上促进材料植入后的血管再生，从而减少并发症的产生［12］。干细胞被认为是理想的组织工程种子细胞，张亚等［13］证明利用脂肪干细胞与多孔丝素材料复合支架具有促进尿道缺损修复的作用；Wu等［14］体外分离培养尿源性干细胞，诱导分化为尿道上皮细胞和尿道平滑肌细胞，并将其接种到改良的多孔小肠黏膜下层支架上，植入裸鼠1个月后，移植物细胞表面可表达尿路上皮细胞和平滑肌细胞标志物。相比干细胞，成体细胞取材和培养过程较为简单，有利于缩短尿道支架的制备时间。林阳彦等［15］用尿道上皮细胞与片状多孔丝素蛋白构成的复合支架修复兔尿道缺损取得了良好的结果。虽然尿道上皮细胞保证了上皮细胞的同源性，但其取材相对繁琐，且容易造成二次损害。兔口腔黏膜上皮与尿道黏膜上皮同属于上皮组织的被覆上皮，均具有防御功能［16］，但兔口腔黏膜上皮细胞具有取材方便、可以分泌β-防御素抑制微生物的侵袭等特点［17］，是理想的尿道支架种子细胞。本研究以兔口腔黏膜上皮细胞作为种子细胞，与PCL纤维尿道支架复合，经体内皮下埋植，结果显示兔口腔黏膜上皮细胞在PCL纤维尿道支架的管腔面形成一层连续的上皮细胞，结合体外的MTT增殖实验，说明无论体外还是实验动物体内，PCL尿道支架均能够支持细胞的生长和增殖，并维持细胞活性。

瘢痕形成是干扰尿道修复的主要难点之一，能导致尿道狭窄、愈合差。如果尿道代替物中包含充足的血管网络就可以避免组织纤维化，减少瘢痕形成等问题，所以组织工程化的尿道替代物与尿道修复是否成功息息相关［18］。Li等［19］将口腔黏膜细胞接种在膀胱脱细胞基质（BAMG）移植物来进行尿道狭窄治疗，虽然目前阶段实验效果理想，但该支架重建尿道的胶原纤维较正常的尿道更加无序，且容易留下瘢痕。本研究制备的兔口腔黏膜上皮细胞与PCL复合尿道管在裸鼠皮下埋植2周后，HE染色结果说明该复合尿道管展现出良好的细胞浸润，推测可能是兔口腔黏膜上皮细胞自身分泌了某些物质或因子，从而促进了PCL纤维尿道管的细胞浸润，而细胞浸润在一定程度上与支架材料的血管化息息相关，从而有可能减少瘢痕等并发症的产生。

综上，本研究制备的兔口腔黏膜上皮细胞与PCL复合支架，经裸鼠皮下埋植实验证明兔口腔黏膜上皮细胞在动物体内依然可以保持良好的新陈代谢，并且与空白PCL相比，兔口腔黏膜上皮细胞的引入使得PCL尿道管的细胞化显著增强，有利于日后用于尿道修复，证实了该管用于尿道修复的可行性。

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（2016-12-12收稿 2017-05-08修回）

（本文编辑 李国琪）

The preparation and feasibility study of composite urethral stent-rabbit oral mucosal epithelial cells and PCL electrospun fiber

GUAN Yong,MENG Qing-ya,XU Guo-dong,ZHANG Fu-yi,SHU Jian-bo
Department of Urology,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300134,China△

E-mail:guanyongyisheng@163.com

ObjectiveTo explore the feasibility of using composite scaffolds of rabbit oral epithelial cells and polycaprolactone(PCL)electrospun fibers for urethral repair.MethodsThe 25%PCL was prepared using a 5∶1 by volume mixture of trichloromethane and anhydrous methanol,and PCL fiber tubular scaffolds were obtained by electrospinning.Rabbit oral mucosa epithelial cells(1.5×105)were implanted on the PCL scaffold.Subsequently,they were embedded in nude mice subcutaneous,explanted in 2 weeks.PCL fiber tubular scaffolds without rabbit oral mucosa epithelial cells were used as control.The complex urethral scaffolds were evaluated by immunofluorescence staining with cytokeratin antibody and HE staining.ResultsCompared with blank PCL group,the rabbit oral mucosa epithelial cell group showed a good cellularization.Rabbit oral mucosa epithelial cells formed a dense cell layer on the surface of PCL lumen,which suggested that rabbit oral mucosa epithelial cells can proliferate on the surface of PCL lumen.ConclusionRabbit oral epithelial cells can be used as one of the seed cells for tissue engineered urethral scaffolds,and it is possible to construct tissue engineering substitute materials for urethral repair by rabbit oral epithelial cells combined with PCL.

mouth mucosa;epithelial cells;tissue engineering;polycaprolactone;urethral stent;electrospinning

R695

：A

10.11958/20161525

天津市卫生局科技基金重点项目（2013KR08）

天津市儿童医院泌尿外科（邮编300134）

关勇（1971），男，医学博士，主任医师，主要从事儿童泌尿外科疾病治疗研究

△通讯作者 E-mail：guanyongyisheng@163.com