高浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞中ghrelin表达的影响

李广阔，赵文，刘勇

高浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞中ghrelin表达的影响

李广阔，赵文，刘勇△

目的探讨葡萄糖对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中ghrelin表达的影响。方法体外培养HUVECs，经过12 h无糖培养后分别观察不同浓度葡萄糖和不同培养时间对ghrelin表达的影响。（1）细胞经0、5、10、15、20 mmol/L葡萄糖处理2 h，RT-PCR法测定ghrelin mRNA表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞裂解液及培养上清中 ghrelin 蛋白水平。（2）细胞以 10 mmol/L 葡萄糖处理 0、0.5、1、2、6、12 h 后，测定 ghrelin mRNA 及其蛋白表达情况。结果（1）随着葡萄糖浓度的升高，ghrelin mRNA及蛋白表达水平出现下降，但当葡萄糖浓度大于15 mmol/L时，继续增加葡萄糖浓度对ghrelin mRNA及蛋白表达无明显影响。（2）在10 mmol/L葡萄糖作用下，随着培养时间的延长，ghrelin mRNA及蛋白表达水平出现下降，当超过6 h后，继续增加作用时间对ghrelin mRNA及蛋白表达无明显影响。结论高浓度葡萄糖可抑制ghrelin的表达，可能是发生动脉粥样硬化的机制之一。

动脉粥样硬化；葡萄糖；ghrelin；脐静脉内皮细胞

Ghrelin是胃部分泌的一种肽类激素，作为生长激素促分泌受体的内源性配体而存在。研究发现，心肌细胞也能合成并分泌ghrelin，并且ghrelin可以抑制心力衰竭患者心肌细胞的凋亡，提高左心室功能，延缓心脏恶病质［1-2］。在心肌梗死动物模型中，ghrelin对心脏重塑的调节具有重要作用，可以抑制心室的扩张［3］。同时ghrelin也可作为预测动脉粥样硬化（AS）的一项指标［4］。机体持续的高血糖同样是AS的危险因素，血管内皮细胞在高血糖的影响下可出现血管内皮细胞凋亡及功能紊乱，但是AS具体的发生机制仍不明确，是否因为失去ghrelin的保护作用而发生尚不清楚。本实验旨在研究高糖对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中ghrelin表达的影响，为进一步探讨高血糖导致AS的发生机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 HUVECs及其相应的DMEM细胞培养基、无糖培养基、胎牛血清、非必需氨基酸均购自国家实验细胞资源共享平台，L-谷氨酰胺、0.25%胰酶消化液购自索莱宝，5%葡萄糖购自大连大冢制药，肝素购自万邦医药，胰岛素购自诺和诺德，青霉素/链霉素购自Gibco，RNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司，反转录试剂盒购自日本Takara公司，人 ghrelin酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自CUSABIO公司，PCR引物由北京奥科公司合成。显微镜购自Olympus公司，PCR仪购自AB公司，酶标仪购自Tecan公司。

1.2 细胞培养 取1 mL HUVECs复苏后，加入到8 mL完全培养基（含10%胎牛血清、4×10-5U/L胰岛素、40 U/mL肝素、1%非必需氨基酸的DMEM培养基）中，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，次日全量更换培养基1次。待细胞生长至80%～90%融合时，0.25%胰酶消化，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次后以1∶2或1∶3的比例传代培养。

1.3 不同浓度葡萄糖和不同培养时间对ghrelin表达的影响 （1）取对数生长期细胞，PBS洗涤细胞1次，更换无糖DMEM 培养 12 h。然后分别以 0、5、10、15、20 mmol/L 葡萄糖干预2 h，每个浓度设置3个复孔，收集培养的细胞及培养基上清用于后续检测。（2）无糖DMEM培养HUVECs 12 h后，以 10 mmol/L 葡萄糖分别干预 0、0.5、1、2、6、12 h 后收集培养的细胞及培养基上清备用，每个时间点设3个复孔。

1.4 半定量RT-PCR检测ghrelin mRNA表达 处理结束后以预冷的PBS洗涤细胞，按照试剂盒说明提取细胞总RNA并逆转录为cDNA。根据NCBI给出的ghrelin基因序列，利用Oligo 6软件设计RT-PCR引物，并在NCBI上进行BLAST验证其特异性。ghrelin引物：上游5′-CCCACAAGCCTTACCACCTC-3′，下游 5′-CCTCTTTGGCCTCTTCCCAG-3′。内参 β-actin引物：上游5′-GGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3′，下游 5′-ATTGCCAATGGTGATGACCTG-3′。PCR 反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL（10 mmol/L），上、下游引物各 0.5 μL（0.2 μmol/L），TakaraEXTaqHS 0.5 μL，cDNA模板 5 μL，RNase Free dH2O 补足至 50 μL。反应条件：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25 个循环；72℃ 7 min，4℃保存。扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳分离，利用凝胶成像仪成像，Image lab分析目的条带灰度值，以ghrelin/β-actin表示ghrelin相对表达量。

1.5 ELISA检测ghrelin蛋白水平 将1.3中收集的细胞以预冷的PBS洗涤1次后重悬，加入1%PMSF于冰上超声裂解，4℃10 000×g离心15 min，收集上清，将细胞裂解液与培养基上清按照ELISA试剂盒说明书设置标准品孔、待测样本孔。每孔分别加入标准品或待测样本100 μL，于37℃温育2 h；随后弃去液体，甩干，加生物素标记抗体工作液100 μL，于37℃孵育1 h，洗涤3次。加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，37℃温育1 h，洗涤5次。加入底物溶液90 μL，37℃避光显色 15～30 min，终止液终止显色。酶标仪记录450 nm处的吸光度（A）值，620 nm作为校正。

1.6 统计学方法 所有数据应用SPSS 19.0进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖对ghrelin mRNA及蛋白表达的影响 结果显示，不同浓度葡萄糖对ghrelin mRNA及蛋白表达水平有影响（F分别为68.871、29.870，均P＜0.01）。随着葡萄糖浓度上升，ghrelin mRNA及蛋白表达水平出现下降，但当葡萄糖浓度大于15 mmol/L时，继续增加葡萄糖浓度对ghrelin mRNA及蛋白表达无明显影响。由于培养上清中ghrelin含量极低，不同浓度葡萄糖处理后ghrelin蛋白表达水平无明显差异（F=6.486）。见图1、2。

2.2 不同处理时间对ghrelin mRNA及蛋白表达的影响 结果显示，不同处理时间对ghrelin mRNA及蛋白的表达有影响（F分别为51.76和147.00，均P＜0.01）。10 mmol/L葡萄糖作用下，与0 h组相比，处理1 h后ghrelin mRNA及蛋白表达水平下降（P＜0.01），随着处理时间的延长，ghrelin mRNA及蛋白表达水平继续下降，当超过6 h后，继续增加作用时间对ghrelin mRNA及蛋白表达无明显影响。10 mmol/L葡萄糖处理不同时间后培养基上清中ghrelin蛋白表达水平差异无统计学意义（F=3.738），见图 3、4。

3 讨论

Ghrelin最初被认为与调节食欲有关，近年来ghrelin在心血管系统疾病中的作用被逐步发现。Kotani等［5］研究显示，血清ghrelin水平的降低与颈动脉内膜和中膜厚度增加有关。Vörös等［6］发现冠状动脉粥样硬化患者ghrelin酰基化水平出现下降，并且ghrelin的水平是由胰岛素水平决定的，可见ghrelin水平可能是预测冠状动脉粥样硬化的一项新型指标。

在健康人中，血液循环中的ghrelin能够影响葡萄糖耐量，同时刺激胰岛素分泌［7］。在对2型糖尿病大鼠的胃组织检测时发现，随着糖尿病病程的延长，ghrelin免疫阳性细胞数明显增加，ghrelin水平显著升高［8］。Ghrelin被认为有抗炎作用，能够抑制HUVECs中细胞因子的释放，激活核因子（NF）-κB和单核细胞，而这一作用可以认为是干预动脉粥样硬化的切入点［9］。然而，ghrelin对血糖的影响机制尚不明确，结论尚存在争议［10］。

Fig.1 Effects of different doses of glucose on expression levels of ghrelin mRNA图1 不同浓度葡萄糖对ghrelin mRNA表达的影响

Fig.2 Effects of different doses of glucose on expression levels of ghrelin protein图2 不同浓度葡萄糖对ghrelin蛋白表达的影响

Fig.3 Effects of different time points of glucose on expression levels of ghrelin mRNA图3 不同葡萄糖作用时间对ghrelin mRNA表达的影响

Fig.4 Effects of different time points of glucose on expression levels of ghrelin protein图4 不同葡萄糖作用时间对ghrelin蛋白表达的影响

本研究通过观察不同葡萄糖浓度和不同干预时间对ghrelin表达的影响，前期预实验发现，当血糖浓度大于25 mmol/L时，细胞出现了部分死亡。同时赵宏等［11］发现33.3 mmol/L葡萄糖干预72 h会显著引起血管内皮细胞凋亡，因此考虑将葡萄糖干预浓度范围确定在0～20 mmol/L。为充分模拟糖尿病患者餐后2 h血糖水平［12］，笔者观察了10 mmol/L葡萄糖干预不同时间对ghrelin的影响。本研究发现，随着葡萄糖浓度的升高以及干预时间的延长，HUVECs中ghrelin表达呈动态下降，但当葡萄糖浓度＞15 mmol/L、干预时间＞6 h后，ghrelin下降不显著。笔者推测可能是HUVECs中存在其他途径能够拮抗高糖的抑制作用。

目前ghrelin在心血管，尤其是AS相关疾病中的保护作用日渐凸显。而高糖抑制ghrelin，使得心血管丧失其保护作用，可能是糖尿病导致AS的原因之一。遗憾的是本文没有进一步观察浓度和时间的交互作用，需体内实验进一步验证ghrelin对心血管的影响。

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（2017-02-04收稿 2017-05-03修回）

（本文编辑 胡小宁）

The effect of high-level of glucose on ghrelin expression in human umbilical vein endothelial cells

LI Guang-kuo,ZHAO Wen,LIU Yong△
Department of Cardiology,Tianjin Fourth Center Hospital,Tianjin 300140,China△

E-mail:13820788667@163.com

ObjectiveTo investigate the influence of high-level of glucose on the expression of ghrelin in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).MethodsAfter 12 h glucose free culturing,the effects of different concentrations of glucose and different incubation times on expressions of ghrelin were observed in HUVECs.(1)The cells were treated with 0,5,10,15,20 mmol/L glucose for 2 h,then ghrelin mRNA expression levels were detected by RT-PCR,and the protein levels of ghrelin were detected by ELISA.(2)The cells were treated with 10 mmol/L glucose for 0,0.5,1,2,6,12 hours,ghrelin mRNA and protein levels were detected respectively.Results(1)The expression levels of ghrelin mRNA and protein decreased along with increased glucose concentrations,which showed no obvious changes when the glucose was above 15 mmol/L.(2)The expression levels of ghrelin mRNA and protein decreased with the prolonged incubation time.But more than 6 h culturing time showed no further effect on reducing the expression level of ghrelin.ConclusionHigh levels of glucose can inhibit the expression level of ghrelin,which may be one of the mechanisms of atherosclerosis.

atherosclerosis;glucose;ghrelin;umbilical vein endothelial cell

R543.3

：A

10.11958/20170146

天津市第四中心医院心内科（邮编300140）

李广阔（1980），男，硕士，主治医师，主要从事心力衰竭、冠心病介入治疗等方面研究

△通讯作者 E-mail:13820788667@163.com