白介素-17基因多态性与肺结核易感性的相关性研究

邱美华 盛云峰 崔岩飞 鲍志坚 杨盛娅

白介素-17基因多态性与肺结核易感性的相关性研究

邱美华 盛云峰 崔岩飞 鲍志坚 杨盛娅

肺结核；白介素-17；基因多态性；易感性

肺结核是全球死亡率最高的传染病，全球大约1/3人口感染过结核分枝杆菌（MTB），然而感染者中大约仅有5%～10%发展为临床肺结核[1]。由此认为个体在结核分枝杆菌易感性方面存在差异。结核易感性与遗传、年龄、性别、环境、营养、吸烟、卡介苗（BCG）接种等高危因素有关。其中遗传因素是影响结核易感性的重要因素，可以影响宿主与MTB间的平衡关系，导致不同的感染结局[2]。此前国内研究报道HLACw、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型（PTPN22）、白介素（IL）-22等基因多态性与肺结核易感性存在一定相关性[3-5]。IL-17主要来源于Th17细胞，近年研究发现，IL-17在防御MTB方面发挥重要作用[6]。国内较少有关IL-17基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与肺结核易感性的研究报道。本文着重探讨IL-17基因多态性与肺结核发病之间的关系，并初步探讨IL-17在肺结核发病中的免疫调节作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择2012年10月—2015年10月在浙江省结核病诊疗中心就诊的肺结核患者（病例组）100例，男61例，女39例，平均年龄（42.8±12.1）岁，平均病程3.8个月。对照组为同期在我院健康体检者100名，男58名，女42名，平均年龄（43.6±11.8）岁。两组研究对象的年龄（t=0.473，P=0.636）和性别构成（χ2=0.187，P=0.666）差异均无统计学意义。肺结核诊断标准：中华医学会结核病学分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》关于肺结核的诊断标准[7]，并排除结核性胸膜炎和肺外结核。对照组入组标准：无肺结核临床表现，无胸部影像学检查异常。两组研究对象均为汉族，无合并其他传染病、慢性病、肿瘤和自身免疫性疾病。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法通过发放问卷调查表获得研究对象的发病危险因素，问卷调查内容包括：性别、年龄、吸烟史、饮酒史、居住地、肺结核患者接触史、肺结核疾病家族史、卡介苗接种史等。肺结核患者根据《肺结核诊断和治疗指南》[7]予以“2个月异烟肼-利福平-乙胺丁醇-吡嗪酰胺/4个月异烟肼-利福平-乙胺丁醇”的初治方案。

1.2.1 抽提外周血DNA抽取两组肘静脉血液10 mL置于EDTA抗凝静脉管中，并放置于-80℃冰箱内备用。采用GenEluteTM Blood Genomic DNA Kit（SIGMA，NA2010-1KT）试剂盒，根据说明书抽提基因组DNA，提取完成的DNA按体积比1：10以TE缓冲液稀释后作为工作浓度存放于-20℃冰箱备用。

1.2.2 基因多态性分析PCR反应引物利用Primer Premier 5软件设计，由上海Invitrogen生物公司合成。IL-17F位点rs763780C/T所用引物为：FP：GCTGAGTGGATATGCACCTCTT，RP：GTTGGAGAAG GTGCTGGTGA，探针为：P-C：FAM-CATCCACCGTG TGCA-MGB，P-T：VIC-CATCCACCATGTGCA-MGB。IL-17A位点rs2275913G/A所用引物为：FP：TAGGA ACATGAATTTCTGCCCT，RP：TCAGGGGTGACACCA TTTTG，探针为：P-G：FAM-TCCTTCAGAAGGAGA G-MGB，P-A：VIC-TCCTTCAGAAGAAGAG-MGB。TaqMan PCR体系为（20μL）：DNA模版1μL、浓度500nmol/L的上下游引物各1μL、DNA酶-free水 6μL、1X qPCR master Mix 10μL，TaqMan探针T/A（250nM）0.5μl，TaqMan探针C/G（250nM）0.5μL（Huirui Biotechnology Co，Ltd，上海，中国）。PCR反应条件为：95℃预变性5min，进入循环后，95℃变性10s加上60℃退火45s，共40个循环。DNA酶-free水作为阴性对照。每个样本做3个重复。

1.2.3 lL-17检测采用ELISA方法测定，严格按照试剂盒说明书操作，以标准品浓度作横坐标，OD450作纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD450值在标准曲线图上查出相应样本的浓度。对每个样本做3个复孔，取其平均值。分别测定对照组、病例组治疗前和治疗后6个月的IL-17水平。

1.3 统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。两组间SNP位点等位基因、基因型频率比较均采用χ2检验，对SNP位点基因型进行Hardy— Weinberg遗传平衡检验。计量资料以表示，两样本均数的比较采用t检验。对肺结核发病危险因素进行Logistic多因素回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 危险因素与肺结核发病间的多因素分析经调查发现，肺结核家族史、结核接触史及卡介苗接种史是肺结核患者发病高危因素（P<0.05），见表1。

表1 危险因素与肺结核发病的分析（例）

2.2 两组研究对象IL-17 SNPs等位基因频率与基因型分布两组基因型和等位基因的分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05）。rs763780的T等位基因频率与C等位基因比较，差异有统计学意义（χ2=3.996，P<0.05）；见表2。两组rs2275913和rs763780基因型和等位基因分布比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。

表2 两组研究对象IL-17 SNPs等位基因频率[例（%）]

表3 两组研究对象IL-17 SNPs基因型分布[例（%）]

2.3 两组研究对象IL-17比较病例组（未治疗）血清IL-17水平与对照组比较明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。抗结核治疗6个月后，病例组IL-17水平明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

表4 两组研究对象IL-17比较（pg/mL）

3 讨论

肺结核主要与细胞免疫有关，当MTB侵入机体后，抗原递呈细胞通过分泌多种细胞因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22等）调节巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞，组成一个复杂的免疫网络，限制和清除MTB。其中IL-17是由Th17细胞分泌的特征性细胞因子，其中IL-17A、IL-17F是其中重要的组成部分，可参与诱导、调节局部组织慢性炎症反应[8]。但IL-17启动子区基因多态性与肺结核间是否具有紧密联系，同时是否通过IL-17表达来影响肺结核发生及治疗等均不完全清楚。本研究中，两组的基本临床资料无明显差异，对其环境因素进行分析后发现，肺结核家族史、接触史及卡介苗接种史是肺结核发病的影响因素，其中肺结核家族史可能与肺结核遗传易感性相关。

IL-17A rs2275913位点和IL-17F rs763780位点是目前研究IL-17最多的两个SNP位点，因SNPs基因型受种族和地区等多种因素影响，所以本次研究均选择浙江省汉族人群实施研究。本研究发现rs2275913和rs763780的基因型与肺结核发病风险无明显相关性，本研究与Abhimanyu等[9]的结果相一致。但据其他文献报道，西班牙人群中IL-17 rs2275913的GG基因型与肺结核高风险存在相关性[10]，Jin等[11]也发现rs763780的CC基因型增加肺结核发病的风险。本研究结果显示，rs763780位点等位基因T显著高于等位基因C（P<0.05），提示rs763780的等位基因T可能是肺结核发病的易感基因，增加肺结核发病风险，与Peng等[12]的研究结果相一致。

IL-17通过CXCL9/10趋化中性粒细胞向感染病灶的部位聚集，并参与结核肉芽肿的形成，还可诱导巨噬细胞吞噬MTB，起到保护作用[13]。本研究显示治疗前病例组IL-17水平显著高于对照组，表明在MTB负荷下，机体Th17细胞分泌大量IL-17，结果与Cowan等[14]的研究相一致。而治疗6个月后IL-17水平显著降低，说明随着细菌负荷量的下降，Th17细胞的刺激因素减少，IL-17分泌减少。由此可以推测IL-17可能成为肺结核疗效观察和预后判断的参考指标。

综上所述，IL-17基因多态性在不同地区、种族中存在不同研究结果。本研究虽得出一定研究数据，也可为肺结核疾病防治提供重要参考，但仍存在不足，如研究样本数量小，不足以代表整个汉族人群，所以尚需扩大研究样本。此外，此次研究的基因位点较少，还需增加基因位点以更深入研究，提高研究结果的可靠性。

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（收稿：2016-08-21修回：2016-10-27）

杭州市科技发展计划项目（No.20120533Q26）

杭州市红十字会医院结核科（浙江省结核病诊疗中心）（杭州310003）

邱美华，Tel：13073694218；E-mail：louie15@sina.com