凉膈散对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织病理学及血中性粒细胞凋亡的影响

周 勇赵 玮

凉膈散对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织病理学及血中性粒细胞凋亡的影响

周 勇1赵 玮2

目的观察凉膈散对内毒素（LPS）致急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织病理学及血中性粒细胞（PMN）凋亡的影响。方法健康雄性SD大鼠72只，随机分为正常对照组、ALI模型组、凉膈散大、中、小剂量组和强的松治疗组，每组12只。LPS（2mg/kg）气管内滴注复制急性肺损伤模型。各组大鼠分别以生理盐水、凉膈散不同剂量、强的松灌胃。计算各组大鼠肺组织病理学积分，流式细胞仪检测PMN的凋亡改变。结果病理学炎症积分：12h模型组高于正常对照组[（2.08±0.12）分比（0.33± 0.03）分，P<0.01]，12h凉膈散大、中、小剂量组均低于模型组[（0.83±0.09）分、（1.00±0.09）分、（1.17± 0.08）分比[（2.08±0.12）分，P<0.01或P<0.05]，24h模型组高于正常对照组[（2.25±0.11）分比（0.41± 0.04）分，P<0.01]，凉膈散大、中、小剂量组均低于模型组[（0.67±0.05）分、（1.17±0.07）分、（1.33±0.06）分比（2.25±0.11）分，P<0.01或P<0.05]。中性粒细胞凋亡指数：12h模型组低于正常对照组[（51.36± 3.99）%比（71.71±4.13）%，P<0.01]，12h凉膈散大、中剂量组高于模型组[（66.37±4.25）%、（61.6± 5.02）%比（51.36±3.99）%，P<0.05]，24h模型组低于正常对照组[（63.04±4.89）%比（80.82±5.19）%，P<0.01]，凉膈散大剂量组高于模型组[（71.32±5.32）%比（63.04±4.89）%，P<0.05]。结论凉膈散可诱导急性肺损伤时中性粒细胞凋亡，抑制中性粒细胞发挥活性作用，从而减轻急性肺损伤肺部炎症反应，其机制可能是通过抑制核转录因子-κB表达实现。

大鼠；急性肺损伤；凉膈散；病理学；中性粒细胞；凋亡

急性肺损伤（ALI）是由非心源性的各种肺内、外致病因素如严重感染、创伤、弥漫性血管内凝血、休克等原发疾病引起，临床主要表现为急性进行性加重的呼吸困难和难治性低氧血症，进一步发展可演变为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）[1]。目前认为过度失调的炎症反应是ALI发生发展的机制之一。在ALI患者肺泡灌洗液中发现中性粒细胞（PMN）是主要的炎性细胞，它一方面可以释放多种如蛋白酶、花生四烯酸、活性氧族等细胞毒性产物导致肺组织损伤；另一方面，它还可以释放一些促炎分子如生长因子、细胞因子和趋化因子等促进炎性反应[2-3]。

凉隔散载于宋《太平惠民和剂局方》，其功效为泻火解毒，清上泄下。文献报道，凉隔散治疗ALI、ARDS获得一定的效果[4-5]，能够抑制内毒素诱导的急性肺损伤小鼠核转录因子-κB（NF-κB）表达的增强，同时还能抑制炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）的表达，减轻肺组织损伤[6]。本课题研究凉膈散对急性肺损伤模型大鼠主要炎性细胞——中性粒细胞凋亡的干预作用，探讨凉膈散治疗急性肺损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性清洁级SD大鼠72只，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 实验药物凉膈散（大黄、朴硝、甘草、栀子各9g，薄荷、黄芩各6g，连翘18g）购自杭州市红十字会医院中药房，水煎浓缩至4g生药/mL；强的松片（浙江仙居制药股份有限公司，批号131089），生理盐水溶至1mg/mL。

1.3 主要实验试剂和仪器膜联蛋白-异氰酸荧光素（Annexin V-FITC）凋亡检测试剂盒（美国Sigma公司），流式细胞仪（美国FACS Calibur公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 分组和造模SD大鼠72只，随机分为正常对照组、ALI模型组、凉膈散大、中、小剂量组和强的松治疗组，每组12只。除正常对照组外，均采用内毒素（LPS）溶液（2mg/kg）气管内滴注复制急性肺损伤模型[7]，1天1次，连续2天。

1.4.2 药物干预从第2次气管内滴注LPS 1h后予药物，每天2次，连续给药3天。正常对照组、ALI模型组每次胃饲生理盐水1mL/100g；强的松治疗组每次胃饲强的松10mg/kg；凉膈散大、中、小剂量组分别予凉膈散11.88g/kg、5.94g/kg、2.97g/kg，加生理盐水稀释至4mL，分2次灌胃。

1.4.3 标本采集造模后12、24h每组各处死6只大鼠，麻醉后剖开腹腔暴露下腔静脉收集血液，血标本离心制备血清，注入加有肝素（浓度500U/mL）0.4mL的试管中以提取PMN。取肺组织，右肺中叶肺组织置于PBS配置的10%甲醛溶液中固定。余肺置－70℃保存。

1.4.4 病理组织学检查右肺中叶肺组织在以PBS配置的10%甲醛溶液中固定24h后，矢状切面右肺门处斜切肺门缘，取厚约5mm肺组织，脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片，分别行HE染色。根据光镜下肺组织炎症细胞浸润和上皮脱落的程度分为4级[8]：“－”未见明显炎症细胞浸润；“+”少量炎症细胞浸润，气管结构完整；“+++”见大量炎症细胞浸润，并可见管壁破坏及（或）上皮脱落；“++”界于“+”和“+++”之间。分别记为0、1、2、3分。

1.4.5 提纯PMN高速低温离心机离心l0min（4℃，2000rpm），取白细胞层及部分血浆与等量D-Hanks液混匀。将稀释血浆、白细胞层沿管壁缓慢叠加于分层液表面，形成清晰界面。离心30min（20℃，2000rpm）。吸弃上清液及薄膜层，沉淀物即为PMN。用红细胞裂解液去除红细胞。离心，弃上清。用D-Hanks液清洗细胞×3次，洗后离心，末次离心后弃上清，加入RMP I-1640培养液重悬细胞待测。

1.4.6 Annexin V和碘化丙啶（PI）双标法测定中性粒细胞凋亡分离纯化后的PMN悬浮于孵育缓冲液中，加Annexin V-FLUOS和PI，室温下孵育15min，流式细胞仪双通道检测5000个细胞，激发波长488nm，发射波长515nm和610nm。Annexin V阳性为凋亡早期细胞，PI阳性为坏死细胞，Annexin V、PI双阳性为凋亡晚期/坏死细胞。以Annexin V+/PI-细胞（右下象限）占所有细胞的百分比表示PMN的凋亡指数[9]。

1.5 统计学方法应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组大鼠病理学炎症积分比较各时相模型组病理学炎症积分均高于正常对照组（P均<0.01），12h凉膈散中、小剂量组高于正常对照组（P<0.05）；12h和24h凉膈散大、中、小剂量组、强的松组均低于模型组（P<0.05或P<0.01），各治疗组之间比较，差异无统计学意义（P均>0.05），见表1。

表1 各组大鼠病理学炎症积分比较

表1 各组大鼠病理学炎症积分比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P< 0.05，△△P<0.01

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2.2 各组大鼠中性粒细胞凋亡指数比较12h、24h模型组中性粒细胞凋亡指数均低于正常对照组（P< 0.01）；12h、24h强的松组均高于模型组（P<0.01或P<0.05），12h凉膈散大、中剂量组高于模型组（P< 0.05），凉膈散小剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），凉膈散小剂量组低于强的松组（P< 0.05）。24h凉膈散大剂量组高于模型组（P<0.05），中、小剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠中性粒细胞凋亡指数比较

表2 各组大鼠中性粒细胞凋亡指数比较

注：与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与强的松组比较，▲P<0.05

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3 讨论

PMN在各种炎性因子如LPS、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-1）的作用下，聚集于肺微血管内皮并被激活，再由肺血管进入肺组织并持续活化，释放一系列损伤介质，引起弥漫性肺泡损害；还通过激活NF-κB从而诱导IL-1β、IL-8、TNF-α等释放引起炎症级联瀑布效应，继而导致ALI[2，9]。凋亡PMN的脱颗粒、呼吸爆发等致炎能力下降，并更容易被吞噬细胞识别、吞噬。吞噬细胞吞噬大量凋亡PMN后，其产生和释放促炎介质的功能受到抑制[10]。炎症反应时，通过快速凋亡机制清除炎症局部的PMN，达到促进炎症消散从而限制肺损伤的目的。但是研究[3]表明，ALI时渗出到肺组织的PMN存在凋亡延迟，存活时间延长，持续释放毒性内容物，造成肺组织的损伤。本研究结果显示，12h、24h模型组中性粒细胞凋亡指数均低于正常对照组（P<0.01），也证明急性肺损伤中存在中性粒细胞凋亡延迟。

中医认为，肺主气，司呼吸，开窍于鼻，肺为娇脏，易感外邪。肺损伤发病多因感受外邪（如邪毒六淫、疠气等），属温病范畴，热迫血瘀，瘀热互结于肺，气机不通，肺通调水道功能失司，水液内停，而致肺水肿；影响气机升降，导致肺气上逆而喘。肺与大肠相表里，肺部邪热下移于大肠，与阳明积滞搏结，大便不通，极易使邪毒淤积肠道，损伤黏膜，进入血液循环，从而加剧脓毒血症，加重肺组织的炎症反应。早期运用清热解毒药，可阻止邪毒入里陷内。凉隔散方中连翘轻清透散，清热解毒，清透上焦之热；薄荷清利头目、利咽；黄芩清透上焦之热，清透胸膈之热；栀子清利三焦之热；竹叶通利小便，引火下行；大黄、栀子泻下通便；整方具有清上通下功效。

本研究结果显示,光镜下凉膈散各干预组肺泡结构破坏或实变、肺泡隔增厚、肺泡腔内、细动脉周围和细支气管壁炎症细胞浸润和红细胞渗出情况均较模型组有较大程度的改善。病理学积分显著降低。提示凉膈散对肺部炎症有抑制作用。

本研究结果显示，中性粒细胞凋亡指数12h凉膈散大、中剂量组高于模型组（P<0.05），24h凉膈散大剂量组高于模型组（P<0.05）。说明急性肺损伤时凉膈散能诱导PMN凋亡。既往有研究报道凉膈散抑制内毒素诱导的小鼠p38MAPK、NF-κB表达的增强[6，11]，此二者与中性粒细胞凋亡有关。纵观目前关于中性粒细胞凋亡的信号通路，主要包括[12]：（1）抑制PMN凋亡的通路：NF-κB存活蛋白通路、ERK信号转导通路、PI3 K-Akt通路；（2）促进PMN凋亡的通路：Fas/Fast通路，p38MAPK信号转导通路。其中NF-κB调控多种参与早期免疫反应和炎性反应的因子，包括肿瘤坏死因子、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、诱导型一氧化氮合酶、环加氧酶2、趋化因子、黏附分子、集落刺激因子等。研究[13]发现，多种核因子κB抑制剂能促进体外培养人血中性粒细胞的自发性凋亡，且呈现出时间依赖性和剂量依赖性，而对肿瘤坏死因子诱导中性粒细胞凋亡具有协同效应。由此推论，凉膈散可能通过抑制内毒素诱导的小鼠NF-κB表达的增强，抵抗NF-κB对中性粒细胞凋亡的抑制作用，从而起到诱导中性粒细胞凋亡的作用，但其具体机制及凉膈散对中性粒细胞凋亡的其他信号通路有无影响，尚有待于进一步研究。

［1］Atabai K，Matthay MA.The pulmonary physician in critcal care.5：acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome：deifnitions and epidemiology［J］.Thorax，2002，57（5）：452-458.

［2］夏长江，孟革，赵建，等.中性粒细胞在急性肺损伤中的作用机制研究进展［J］.国际药学研究杂志，2009，369（6）：418-422.

［3］叶正龙，徐巧莲，邱海波.中性粒细胞凋亡在大鼠急性肺损伤发病机制中的意义［J］.中国急救医学，2004，25（7）：503-505.

［4］姚咏明，柴家科，林洪远.现代脓毒症理论与实践［M］.北京：科学出版社，2005：1112-1114.

［5］李志文，张凤敏，莫顺景，等.中西医结合治疗急性肺损伤疗效观察［J］.中国中医急症，2004，13（9）：574-575.

［6］林慧，余林中，秦清和.凉膈散对内毒素肺损伤小鼠肺组织核因子-κB活性的影响［J］.四川中医，2004，22（7）：16-18.

［7］赵玮，王砚，唐法娣，等.LPS致大鼠急性肺损伤TLR4的表达及蓝桉油的影响［J］.中国中药杂志，2006，31（4）：319-322.

［8］王非，何神娣，张长志，等.清瘟败毒饮对大鼠急性肺损伤保护作用的研究［J］.中国中医药科技，2013，20（2）：117-118.

［9］徐晓武，杨小敏，金洲祥，等.槲皮素对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠肺泡中性粒细胞凋亡的影响［J］.中国病理生理杂志，2013，29（3）：499-503.

［10］Abraham E.Neutrophils and acute lung injury［J］.Crit Care Med，2003，31（4）：S195-199.

［11］江爱达，余林中，林慧，等.凉膈散对LPS诱导的巨噬细胞丝裂素活化蛋白激酶p38活性的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2005，11（7）：511-513.

［12］芮萌，段蕴铀.中性粒细胞凋亡与急性肺损伤［J］.中国急救医学，2008，28（12）：1129-1132.

［13］Chen A，Seifert HS.Neisseria gonorrhoeae-mediated inhibition of apoptotic signalling in polymorphonuclear leukocytes［J］.Infection Immunity，2011，79（11）：4447-4458.

（收稿：2016-11-20修回：2016-12-19）

Effect of Lianggesan on Histopathology of Lung Tissue and the Apoptosis of Polymorphonuclear Granulo－cytes in a Rat Model of Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury

ZHOU Yong1,ZHAO Wei21 Department of Leader Health,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003),China;2 Research Center of Respiration Physiological Functions,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Lianggesan on the histopathology accumulated points of lung tis sue and the apoptosis of polymorphonuclear granulocytes（PMN）in blood from rats with lipopolysaccharide（LPS）in duced acute lung injury.MethodsSeventy-two healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups（n=12）: control group,model group,prednisone group and the Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups.The LPS solution（2mg/kg）was instilled into the trachea to prepare rat acute lung injury model except control group,once a day for two days.Each treatment group completed the second infusion 1 hour after LPS solution.The drugwas intragastric administration twice a day.After each group were instilled 12h,24h,6 rats were put to death to collect the required samples.The apoptosis of PMN was detected with flow cytometer.ResultsAt 12h after instilled,the pathology accumulated points in model groupwas higher than that in control group（2.08±0.12 vs 0.33±0.03,P<0.01）),that in Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups were lower than that in model group（0.83±0.09,1.00±0.09, 1.17±0.08 vs 2.08±0.12,P<0.01 or P<0.05）;at 24h after instilled,the points in model group was higher than that in control group（2.25±0.11 vs 0.41±0.04,P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups were lower than that in model group（0.67±0.05,1.17±0.07,1.33±0.06 vs 2.25±0.11,P<0.01 or P<0.05）.The apoptosisof PMN at 12h after instilled in model group was lower than that in control group（51.36%±3.99%vs 71.71%±4.13%, P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-and middle-dose groups were higher than that in model group（66.37%± 4.25%,61.6%±5.02%vs 51.36%±3.99%,P<0.05）;the apoptosis at 24h after instilled in the model groupwas lower than that in control group（63.04%±4.89%vs 80.82%±5.19%,P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-dose groupwas higher than that in model group（71.32%±5.32%vs 63.04%±4.89%,P<0.05）.ConclusionLianggesan can induce the apoptosis of PMN,lighten the inflammatory reaction of lung tissue in acute lung injury.The underlying mechanism may be related to suppressing the expression of NF-κB.

rats;acute lung injury;Lianggesan;pathology;polymorphonuclear granulocytes;apoptosis

浙江省中医药科技计划项目（No.2011ZA083）

1杭州市红十字会医院干部保健科（杭州310003）；2浙江中医药大学附属第一医院呼吸生理研究中心（杭州310006）

周勇，Tel：0571-56109768