几种药用植物内生细菌对苹果腐烂病菌(Valsamali)抑菌效果研究

郭薇，殷辉，周建波，吕红，张志斌，赵晓军，刘慧平，韩巨才＊

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.山西省农业科学院植物保护研究所，山西 太原 030031；3.农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西 太原 030031)

几种药用植物内生细菌对苹果腐烂病菌(Valsamali)抑菌效果研究

郭薇1,2,3，殷辉2,3，周建波2,3，吕红2,3，张志斌2,3，赵晓军2,3，刘慧平1，韩巨才1＊

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.山西省农业科学院植物保护研究所，山西 太原 030031；3.农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西 太原 030031)

[目的]为明确已分离的13株药用植物内生细菌对苹果腐烂病菌(V.mali)的抑菌效果。[方法]采用平板对峙法和生长速率法测定了13株供试菌株活菌及其发酵液对苹果腐烂病菌(V.mali)的抑菌率，并对其进行了聚类分析。[结果]依据活菌抑菌率聚类分析结果可将13株菌分为两类：第Ⅰ类为DS-1、CJ-2、DS-3、ZY-1、MY-1、DS-9、MH和MY-4，抑菌率范围为81.88%～83.65%；第Ⅱ类为ZJ-2、L-23、ZJ-1、ZJ-3和CJ-1，抑菌率范围为79.76%～81.29%。依据发酵液抑菌率聚类分析结果可将13株菌分为两类：第Ⅰ类为MY-1、MY-4、CJ-1、CJ-2、ZJ-1、DS-3和ZJ-3，抑菌率范围为60.00%～81.53%；第Ⅱ类为ZJ-2、MH、DS-9、L-23、ZY-1和DS-1，抑菌率范围为12.94%～43.24%。对13株菌的活菌及其发酵液抑菌率进行综合聚类分析，可将13株菌分为四类。其中第Ⅰ类抑菌活性最强，抑菌率范围为68.29%～83.65%，包含所有拮抗菌活菌和MY-4、MY-1的发酵液。[结论]因此，对拮抗菌MY-4和MY-1可以开发其活菌及发酵液来防治苹果树腐烂病；对于其余11株菌，可开发其活菌来防治苹果树腐烂病。

药用植物； 内生细菌； 腐烂病； 黑腐皮壳菌； 抑菌效果

苹果是我国重要的经济作物，其栽培面积在2012年已超过200万hm2[1]。在苹果的高产优质栽培中，病害成为制约产业发展的重要因子[1]。苹果树腐烂病是由子囊菌亚门黑腐皮壳菌属(Valsaspp.)真菌引起的一种重要的枝干病害。该病危害严重，常造成树势衰弱，果实产量下降，严重的还会造成树木枯死甚至毁园[2]。该病分布广泛，在我国各个苹果种植区都有其发病的报道[3]。近年来，苹果树腐烂病发病日趋严重，病株率逐年增加，已报道有部分苹果产区的腐烂病平均病株率已达到70%以上[3，4]。

目前，生产上主要在苹果树发病后通过对其进行刮皮、涂抹[5]化学农药的方法对苹果腐烂病进行防治，主要使用的化学农药有：石硫合剂、戊唑醇、苯醚甲环唑、甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯、腐殖酸铜等[6～8]。但长期使用化学防治方法易使果树产生抗药性，同时还会造成果园生态环境恶化。因此，我们急需寻求一种环境友好且高效的防治方法。

药用植物是一类具有特殊化学成分和生理功能的植物类群。其内部微生物种类丰富，并能够产生与寄主植物相同或相似的活性成分，包括抗肿瘤类、抗菌类和免疫类活性成分，是具有巨大的开发潜力和研究价值的生防菌资源[9]。迄今为止，国内外学者已发现不少从药用植物中分离出的微生物对不同的植物病害有拮抗作用：毕江涛等[10]、梁子宁等[11]、赵龙飞等[12]、杜晓宁等[13]先后报道了从药用植物沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)、鸦胆子(Bruceajavanica)、枸骨(Ilexcornuta)、枸杞(Lyciumchinese)等中分离出的多种内生细菌对多种植物病原真菌(枸杞黑果病菌、小麦全蚀病菌、柑桔绿霉病菌、香蕉煤纹病菌、棉花枯萎病菌、番茄炭疽杆菌、玉米大斑病菌)都具有显著的拮抗效果。同时，在利用微生物防治苹果树腐烂病方面，被报道的拮抗菌种类多样，遍及真菌、细菌和放线菌：真菌有链格孢属(Alternaria)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、深绿木霉(T.atroviride)、螺旋毛壳(Chaetomiumspirale)[14，15]等，细菌有微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)[16，17]等，放线菌有卡伍尔链霉菌(Streptomyces cavourensis)[18]等。利用药用植物内生菌防治苹果树腐烂病有巨大的研究潜力和价值。

本试验将采用平板对峙法和生长速率法研究已分离的13株药用植物内生菌对苹果腐烂病菌(V.mali)的抑菌效果，以期为苹果腐烂病生防菌株的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌为苹果腐烂病菌(V.mali)，菌株编号为JZ144，ITS和EF1α的GenBank登录号为KX196241和KX273811。

供试拮抗菌分离自5种药用植物，共13株。其菌株编号及来源见表1。

表1 13株供试拮抗菌菌株编号及来源

Table 1 The number and source of 13 tested antagonistic bacteria

菌株编号Number来源Source部位Part菌株编号Number来源Source部位PartDS⁃1丹参叶ZJ⁃2醉鱼草茎DS⁃3丹参叶ZJ⁃3醉鱼草茎DS⁃9丹参叶ZY⁃1醉鱼草叶L⁃23酸枣根MH曼陀罗花CJ⁃1柽柳茎MY⁃1曼陀罗叶CJ⁃2柽柳茎MY⁃4曼陀罗叶ZJ⁃1醉鱼草茎

拮抗菌平板对峙试验采用PDA培养基，拮抗菌发酵液培养采用NB培养基。

1.2 方法

1.2.1 内生拮抗菌的筛选

内生拮抗菌的筛选采用平板对峙法[19]。用直径为5 mm的打孔器在培养3 d的苹果腐烂病菌(V.mali)上打取菌饼，将菌饼接到PDA平板中央，并在其四周距其2 cm处接入拮抗菌，以不接拮抗菌作为对照。每个处理重复三次。将接种好的平板放入25 ℃恒温培养箱中倒置培养，待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量病原菌菌落直径，并计算抑菌率。

抑菌率/%=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-5 mm)×100

菌落直径/mm

1.2.2 拮抗菌发酵液抑菌效果的筛选

拮抗菌发酵液抑菌效果筛选采用生长速率法[20]。将发酵液与PDA以1∶9的比例制成平板。用直径为5 mm的打孔器在培养3 d的苹果腐烂病菌(V.mali)上打取菌饼，将菌饼接到含有发酵液的平板中央，以接种到PDA平板作为对照。每个处理重复3次。将接种好的平板放入25 ℃恒温培养箱中倒置培养，待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量病原菌菌落直径，并计算抑菌率。

计算公式同1.2.1。

1.3 数据处理

采用Excel 2003进行数据处理，并采用SPSS 17.0软件对数据进行差异性分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 13株拮抗菌活菌对腐烂病菌(V.mali)的抑菌效果及聚类分析

13株拮抗菌活菌对腐烂病菌(V.mali)的抑菌率均在79%以上。其中菌株ZJ-2抑菌率最低，为79.76%。菌株MH抑菌率最高，为83.65%。13株拮抗菌活菌对腐烂病菌(V.mali)的平均抑菌率为81.87%(图1，A)。从图1A中可知，菌株ZJ-2与L-23之间、MY-4与DS-9之间以及DS-9与MH之间均无显著差异。除此之外，菌株之间两两相比差异均达极显著水平。

图1 13株拮抗菌活菌对腐烂病菌(V. mali)的抑菌率及聚类分析图 A：13株拮抗菌活菌对腐烂病菌(V. mali)的抑菌率； B：13株拮抗菌活菌对腐烂病菌(V. mali)抑菌率的聚类分析图Fig.1 Inhibitory rate and cluster analysis of the live bacteria of 13 antagonistic bacteria to V. mali A: Inhibitory rate of the live bacteria of 13 antagonistic bacteria to V. mali； B: Cluster analysis of inhibitory rate of the live bacteria of 13 antagonistic bacteria to V. mali 注：图A中柱形上方字母为差异性分析结果，其中大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。Note: The letters above the column in figure A are the result of analysis of variance. The different capital letters indicate extremely significant differences (P<0.01). The different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).

以13株拮抗菌活菌对腐烂病菌(V.mali)的抑菌率进行聚类分析。结果表明以欧式距离10作为聚类分割点，可将13株菌分为两类(图1，B)。第Ⅰ类包含8株菌，分别为：DS-1、CJ-2、DS-3、ZY-1、MY-1、DS-9、MH和MY-4，该类型菌株的抑菌率范围为81.88%～83.65%。第Ⅱ类包含5株菌，分别为：ZJ-2、L-23、ZJ-1、ZJ-3和CJ-1，该类型菌株的抑菌率范围为79.76%～81.29%。第Ⅰ类菌株的抑菌效果优于第Ⅱ类。

2.2 13株拮抗菌发酵液对腐烂病菌(V.mali)的抑菌效果及聚类分析

13株拮抗菌发酵液对腐烂病菌(V.mali)的抑菌率范围为12.94%～81.53%，其中菌株ZJ-2发酵液抑菌率最低，为12.94%。菌株MY-1发酵液抑菌率最高，为81.53%。13株拮抗菌发酵液对腐烂病菌(V.mali)的平均抑菌率为51.04%(图2，A)。从图2A中可知，菌株MY-4与MY-1之间无显著差异。除此之外，菌株之间两两相比差异均达极显著水平。

以13株拮抗菌发酵液对腐烂病菌(V.mali)的抑菌率进行聚类分析。结果表明以欧式距离10作为聚类分割点，可以将13株菌分为两类(图2，B)。第Ⅰ类包含7株菌，分别为：MY-1、MY-4、CJ-1、CJ-2、ZJ-1、DS-3和ZJ-3，该类型菌株发酵液的抑菌率范围为60.00%～81.53%。第Ⅱ类包含6株菌，分别为：ZJ-2、MH、DS-9、L-23、ZY-1和DS-1，该类型菌株发酵液的抑菌率范围为12.94%～43.24%。第Ⅰ类菌株的抑菌效果优于第Ⅱ类。

图2 13株拮抗菌发酵液对腐烂病菌(V. mali)的抑菌率及聚类分析图 A：13株拮抗菌发酵液对腐烂病菌(V. mali)的抑菌率； B：13株拮抗菌发酵液对腐烂病(V. mali)抑菌率的聚类分析图Fig.2 Inhibitory rate and cluster analysis of 13 fermentation broth of antagonistic bacteria to V. mali A：Inhibitory rate of 13 fermentation broth of antagonistic bacteria to V. mali； B：Cluster analysis of inhibitory rate of 13 fermentation broth of antagonistic bacteria to V. mali 注：图A中柱形上方字母为差异性分析结果，其中大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。Note: The letters above the column in figure A are the result of analysis of variance. The different capital letters indicate extremely significant differences (P<0.01). The different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).

2.3 13株拮抗菌活菌及其发酵液对腐烂病菌(V.mali)抑菌率的聚类分析

对13株拮抗菌活菌及其发酵液的抑菌率进行聚类分析。结果表明以欧式距离6作为聚类分割点，可以将13株菌分为四类(图3)。第Ⅰ类为最优组，抑菌活性最强，抑菌率范围为68.29%～83.65%，该组包含所有拮抗菌活菌以及MY-4和MY-1的发酵液。第Ⅱ类为次优组，该组包含2株拮抗菌的发酵液，分别为菌株DS-3和ZJ-3，其抑菌率分别为60.00%和64.12%。第Ⅲ类抑菌活性最小，包括2株拮抗菌的发酵液，分别为菌株ZJ-2和MH，其抑菌率分别为12.94%和17.65%。第Ⅳ类包括4株拮抗菌的发酵液，分别为菌株L-23、DS-9、ZY-1和DS-1，其抑菌率范围为24.71%～43.24%。

图3 13株拮抗菌活菌及其发酵液对腐烂病菌(V. mali)抑菌率聚类分析图Fig.3 Cluster analysis of inhibitory rate of live bacteria and fermentation broth of 13 antagonistic bacteria to V. mali 注：编号上标为^代表活菌，编号上标为*代表发酵液Note：Superscript ^ means the live bacteria. Superscript * means the fermentation broth of antagonistic bacteria.

3 结论与讨论

当前，已报道的苹果树腐烂病生防细菌主要有微嗜酸寡氧单胞菌(S.acidaminiphila)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)[16，17]。根据王彩霞等[16]，王卫雄等[17]的研究结果发现，以上3种生防细菌活菌及其发酵液对腐烂病菌的抑菌效果均良好，菌株抑菌率分别为78.73%、79%和85%，发酵液抑菌率分别为70.54%、74%和77%。本实验13株供试拮抗菌的活菌抑菌率及MY-1、MY-4的发酵液抑菌率范围与上述研究结果基本一致，可作为苹果腐烂病生防菌进行深入研究。另外，上述研究结果中3种生防细菌活菌抑菌率均高于其发酵液抑菌率，与本实验结果一致。

本实验研究的13株药用植物内生细菌中，抑菌效果较好的包括所有拮抗菌的活菌以及MY-1、MY-4的发酵液。除MY-1、MY-4外，其余11株拮抗菌则是活菌抑菌效果好而发酵液抑菌效果较差。尤其是MH，其发酵液和活菌的抑菌率相差较大。造成以上结果的原因可能是菌株的个体差异性导致其分泌的物质活性大小不同，可分别对抑菌效果较好的活菌和发酵液进行深入研究。

大量研究证明，药用植物内生菌具有丰富的多样性，并能够产生与寄主植物相同或相似的活性物质，是一类宝贵的内生菌资源库[9]。本实验研究了分离自丹参、酸枣、柽柳、醉鱼草和曼陀罗5种药用植物的拮抗菌，丰富了药用植物内生拮抗菌资源库。另外我们发现分离自曼陀罗的三株菌的总体抑菌效果都较好(除分离自曼陀罗花的菌株MH的发酵液，这可能是因为菌株个体差异)。分离自酸枣、醉鱼草的菌株相对来说抑菌效果较差。但本实验存在局限，供试拮抗菌数量较少，还需要进一步深入研究。

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(编辑：张贵森)

Study on the bacteriostatic effect of endophytic bacteria in several medicinal plants toValsamali

Guo Wei1,2,3, Yin Hui2,3, Zhou Jianbo2,3, Lv Hong2,3, Zhang Zhibin2,3, Zhao Xiaojun2,3, Liu Huiping1, Han Jucai1＊

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.InstituteofPlantProtection,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan,Shanxi030031,China; 3.ShanxiKeyLaboratoryofIntegratedPestManagementinAgriculture,Taiyuan030031,China)

[Objective]In order to clearing the antibacterial effect of the 13 endophytic bacteria isolated from medicinal plant toV.mali. [Methods]we studied the inhibition effect of live bacteria and fermentation broth of 13 endophytic bacteria toV.maliby using pair culture method and plate growth rate method.13 endophytic bacteria could be divided into two types according to the cluster analysis of inhibitory rate of live bacteria. [Results]The first type included DS-1,CJ-2,DS-3,ZY-1,MY-1,DS-9,MH and MY-4,whose inhibitory rate was in the range of 81.88% to 83.65%. The second type included ZJ-2,L-23,ZJ-1,ZJ-3 and CJ-1, whose inhibitory rate was in the range of 79.76% to 81.29%.13 strains could be divided into two types according to the cluster analysis of inhibitory rate of the fermentation broth. The first type included MY-1、MY-4、CJ-1、CJ-2、ZJ-1、DS-3 and ZJ-3 and the range of their inhibitory rate was 60.00% to 81.53%. The second type included ZJ-2、MH、DS-9、L-23、ZY-1 and DS-1,whose inhibitory rate was in the range of 12.94% to 43.24%. The cluster analysis of the inhibitory rate of the live bacteria and fermentation broth showed that the strains could be divided into four groups and the first group was the optimal group with the strongest antibacterial effect from 68.29% to 83.65%. This group included all the live bacteria of the 13 antagonistic bacterial and the fermentation broth of MY-4 and MY-1. [Conclusion]Therefore, we could develop the live bacteria and fermentation broth of MY-1, MY-4 and the live bacteria of the other 11 bacteria to prevent the apple canker (V.mali).

Medicinal plant， Endophytic bacteria， Apple canker，Valsamali， Bacteriostatic effect

2017-01-19

2017-02-07

郭薇(1993-)，女(汉)，山西太原人，硕士，研究方向：农药毒理与生物农药

*通信作者：韩巨才，教授，博士生导师，Tel:13753447063；E-mail:sxndhjc@163.com

山西省重点研发计划项目(201603D221013-3)；山西省青年科技研究基金(面上青年基金项目)(201601D202073)

S182; Q93

A

1671-8151(2017)06-0402-06