北京规模化猪场病毒性腹泻隐性感染情况调查

刘 邓 贾泽颖 张 丹 全炎铭 郭又春 刘莉如 刘修全 陈华林

（北京三元集团畜牧兽医总站，北京 100192）

北京规模化猪场病毒性腹泻隐性感染情况调查

刘 邓 贾泽颖 张 丹 全炎铭 郭又春 刘莉如 刘修全 陈华林*

（北京三元集团畜牧兽医总站，北京 100192）

为了解PEDV、TGEV和RV在猪群中的隐性感染情况，对北京市8个规模化养猪场开展流行病学调查。本次调查共采集到440份临床健康粪样，利用多重FQ-RT-PCR的方法进行检测，结果表明：PEDV、RV、TGEV的阳性率分明为14.1%、13.6%和3.2%；不同阶段的猪群中，PEDV在保育-育肥阶段阳性率最高，达到25.4%；RV在仔猪阶段阳性率最高，达到27.3%；TGEV在保育-育肥阶段阳性率为8.5%。由此可知，规模化猪场PEDV、TGEV和RV隐性感染情况较为严重。

猪病毒性腹泻；FQ-RT-PCR；隐性感染

猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,RV）和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起规模化猪场猪群腹泻的主要病原，一年四季均能发生，对仔猪的危害较为严重[1-2]。近几年时有暴发，且波及面较广，并呈现高发病率高死亡率的趋势，给我国养猪业带来了极为严重的损失[3-5]。据调查部分规模化猪场在时间上呈现为波浪式暴发，为了解该情况出现的潜在因素，本研究采集北京市郊的8个规模化养猪场的440份临床健康猪粪，进行PEDV、TGEV和RV病原学方面的检测，从而为猪病毒性腹泻的防控提供依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂

一步法荧光定量RT-PCR试剂盒，购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。

1.1.2 主要仪器设备

ABI 7500荧光定量PCR仪购自于Thermo Fisher公司；高速冷冻离心机购自德国贺利氏仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品来源

采集自北京周边某养殖公司下辖8个种猪场共440份临床健康猪新鲜粪样，其中：母猪（Ⅰ组）159头份、保育-育肥猪（Ⅱ组）142头份、仔猪（Ⅲ组）139头份。

1.2.2 样品前处理

从粪样采集管中取出一定量的粪样转移进1.5 mL离心管中，分别加入500 μL无菌生理盐水，涡旋振荡器上混匀，以8 000 r/min转速离心15 min，吸取上清转移至新的离心管中待检。

1.2.3 RNA提取

按照QIAGEN公司的RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。往1.5 mL离心管中加入560 μL AVL裂解液，随后加入150 μL样品涡旋混合15 s静置10 min，瞬时离心后加入560 μL无水乙醇涡旋混合，转移至收集管中，8 000 r/min离心1 min，弃掉废液后收集管中加入500 μL AW1液体，8 000 r/min离心1 min，弃掉废液后，收集管中加入500 μL AW2液体，14 000 r/min离心3 min，弃掉废液后，14 000 r/min空离2 min，加入60 μL AVE，静置1 min后，8 000 r/min离心1 min，做好标记，-80℃冻存待用。

1.2.4 多重FQ-RT-PCR检测

采用本实验室建立的多重FQ-RT-PCR方法进行检测，该检测方法能够同时检测PEDV、TGEV和RV三种病原，并设立阴阳性对照，当荧光定量PCR仪能够收集到明显的扩增信号时则判定为阳性（CT值＜35）；荧光信号增强不明显（40＞CT值≥35）判定为可疑，需要复检，复检后如果40＞CT值≥35则判定为阳性；无荧光信号增强则判为阴性，其具体的反应体系以及反应条件如下：2×One Step RT-PCR Buffer III 25μL，TaKaRa Ex Taq TM HS（5 U/μL）1.5 μL，PrimeScript RT enzyme Mix II 1.0 μL，（PEDV/TGEV/RV）PCR Forward Primer（10 μM），（PEDV/TGEV/RV）PCR Reverse Primer （10 μM），（PEDV/TGEV/RV）Probe（10 μM），total RNA 10 μL，合计50μL。反应条件：（反转录）42℃30min；（预变性）95℃30 s；95℃15 s；56℃30 s（退火延伸收集荧光信号），40个循环。

2 试验结果

2.1 PEDV、TGEV、RV总体隐性感染状况

采用多重FQ-RT-PCR方法对8个种猪场440份临床健康猪粪进行检测，可疑样品进行复测，总体检测结果如表1所示。2个种猪场PEDV、TGEV、RV阳性率均为0；其余6个猪场以隐性感染PEDV和RV为主，PEDV阳性率最高达到43.3%，RV阳性率最高达到31.7%，整体上PEDV阳性率为14.1%、RV为13.6%，而TGEV阳性率只有3.2%。

2.2 不同阶段猪群隐性感染情况

由表2知，不同日龄阶段的猪群PEDV和RV均有隐性感染，TGEV在仔猪群没有检测到。PEDV隐性感染在保育-育肥阶段阳性率最高达到25.4%；RV隐性感染在仔猪阶段阳性率最高达到27.3%；TGEV隐性感染在各阶段猪群均不高，保育-育肥阶段阳性率最高，为8.5%，仔猪阶段感染率为0。

表1 8个种猪场3种病原隐性感染情况

表2 不同日龄猪群隐性感染情况

2.3 混合感染情况

本次抽样调查的440份临床健康粪样中，PEDV和RV混合感染8份，混合感染率为1.8%；PEDV、RV和TGEV混合感染9份，混合感染率为2.0%。

3 结论

根据本次试验开展的北京规模化猪场病毒性腹泻隐性感染情况调查可知，PEDV、TGEV和RV这三种较为常见的猪群腹泻致病原中，隐性感染以PEDV为主（14.4%），其次为RV（13.6%），TGEV隐性感染率最低（3.2%），调查结果同近些年来国内报道猪病毒性腹泻发病感染情况基本一致。杜鹃等[6]采用多重RT-PCR方法，于2012—2013年间对北京部分区县1 201份样品进行监测，结果显示：PEDV阳性率4.66%，TGEV阳性率2.58%，RV阳性率6.16%。薛瑞雪等[7]采用RT-PCR方法对2013年10月至2014年10月采集的226份腹泻样品进行检测，结果显示：226份病料样品中PEDV、TGEV和RV的阳性率分别为34.96%、2.21%和28.76%，PEDV与RV的混合感染率为3.10%，表明PEDV和RV为山东仔猪腹泻的主要病原，并存在多种病原混合感染情况。而本研究针对的主要是临床健康猪群的流行病学调查，因此数据上看略高于其他文献报道，根据猪场实际生产情况分析，极有可能与部分猪场在调查前3—4个月有病毒性腹泻暴发有关，因此在猪群发生病毒性腹泻后，隐性感染情况会持续较长的一段时间。

本次调查中，不同阶段的猪群其隐性感染情况也有较为明显的区别，其中PEDV和RV在仔猪以及保育-育肥阶段的隐性感染率较高，而TGEV在仔猪阶段的隐性感染率为0，其他阶段也有隐性感染，但较低，同国内这方面的调查也基本相似。刘云波等[8]于2011—2012年间采用多重RT-PCR方法对13个省市的猪腹泻以及临床健康样品进行了检测，结果显示：临床健康样品中，保育-育肥猪PEDV、RV阳性率分别为2.13%和1.42%，仔猪RV阳性率达到12.86%，表明PEDV和RV存在有隐形感染情况。

本研究表明，规模化猪场中PEDV、TGEV和RV的隐性感染情况较为突出，而且有研究表明目前病毒性腹泻的暴发季节性越来越不明显，田云等[9]在2012年通过对广东省猪群流行性腹泻的流行病学调查发现免疫率高、生物安全措施好的猪场发病率和死亡率均较低，因此病毒性腹泻的防控应以预防为主。

[1]李瑞香,王翠萍.猪病毒性腹泻病的流行特点及防控措施[J].畜牧与饲料科学,2016,37(2):111-112.

[2]Chae C,Kim O,Choi C,et al.Prevalence of porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs[J].Vet Rec,2000,147(21):606-608.

[3]Ben Salem AN,Chupin Sergei A,Bjadovskaya Olga P,et al.Multiplex nested RT-PCR for the detection of porcine enteric viruses[J].J Virol Methods,2010,165(2):283-293.

[4]秦谷雨,杨勇,李郁,等.安徽省仔猪腹泻5种病毒感染情况的调查研究[J]．动物医学进展,2012,33(12):59-63.

[5]黄毓茂.当前猪病毒性腹泻流行特点与防控建议[J]．中国猪业,2012(11):21-22.

[6]杜鹃,韦海涛,周德刚,等.北京地区猪主要病毒性腹泻疾病的流行病学调查[J].中国兽医杂志,2015,51(3):24-26.

[7]薛瑞雪,田野,田夫林,等.山东省部分地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J].中国预防兽医学报,2015,37(4):254-257.

[8]刘云波,赵洪翠,王志成,等.猪病毒性腹泻分子流行病学调查[J].中国畜牧兽医,2013,40(2):204-207.

[9]田云,孙彦伟,王福广,等.2012年广东猪群腹泻流行病学调查[J].广东畜牧兽医科技,2015,40(3):19-22.

S852.65

A

1673-4645(2017)04-0032-03

2017-01-18

刘邓（1981-），男，硕士，兽医师，主要从事畜禽疫病诊断，E-mail：9465245@qq.com*

陈华林（1966-），男，高级兽医师，主要从事畜禽疫病防控