苎麻脱胶果胶复合酶的优选及其效果分析

成莉凤， 刘正初， 冯湘沅， 汪启明， 李 琦，3，郑 科， 杨 琦， 段盛文

苎麻脱胶果胶复合酶的优选及其效果分析

成莉凤1， 刘正初1， 冯湘沅1， 汪启明2， 李 琦1，3，郑 科1， 杨 琦1， 段盛文1

(1. 中国农业科学院 麻类研究所， 湖南 长沙 410205； 2. 湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128； 3. 湖南利尔康生物股份有限公司， 湖南 岳阳 414100)

为研发高效苎麻脱胶酶制剂，对筛选并保藏的苎麻脱胶高效菌种进行液态发酵，测定胞外酶的果胶酶活力、甘露聚糖酶活力和蛋白质含量等特征参数。通过苎麻酶法脱胶，从纤维表观形态学、质量损失率、残胶率等方面综合分析苎麻脱胶效果。结果表明：第N组和第G组的果胶酶活力较优，分别为61.79、13.69 IU/mL，比酶活力分别为4.47、0.93 IU/mg；第N组和第G组的纤维素酶活力仅为0.01、0.02 IU/mL；第N组和第G组苎麻质量损失率分别为20.30%和18.69%，残胶率分别为2.52%和4.21%，均接近实际工业化应用水平；第N组的单纤维线密度为5.31 dtex，束纤维断裂强度为4.8 cN/dtex，属于优质脱胶苎麻纤维。

苎麻； 脱胶； 果胶酶； 半纤维素； 纤维形态

苎麻纤维是世界上重要的天然纤维来源之一[1]。农产品苎麻除含有大量纤维素纤维外，还包含有4%～8%果胶、12%～18%半纤维素、0.8%～1.5%木质素等胶质成分[2]。无论利用苎麻开发何种纺织产品，都必须经过“脱胶”这道关键工序，除去非纤维素物质。传统的沤麻存在生产环境恶劣，劳动强度大，产品质量不稳定等明显不足[3]。化学脱胶存在成本高，纤维品质易受损伤和环境污染严重等突出问题，制约了麻类加工业的发展[4]。生物脱胶可克服上述缺点，具有高效、节能、降耗、减排等优点，是苎麻加工行业的发展方向[5]。

NY/T 1537—2007《苎麻生物脱胶技术规范》指出，苎麻胶质复合体结构复杂，其生物降解需果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等非纤维素降解酶在内的关键复合酶系协同作用。已有研究发现，脱胶前期果胶酶对苎麻胶质的降解效率远高于木聚糖酶，并证实果胶酶降解苎麻原麻起“黏合”作用的果胶质，使细胞结构松散，促进半纤维素酶类和其他脱胶因子的有效渗透，从而提高脱胶复合酶体系的降解效率[6]。因此，果胶酶作为苎麻生物脱胶的“引发酶”被认为是最关键的因子，通常将果胶酶活力高低作为脱胶酶制剂优劣的一个重要指标[7]。本文拟采用苎麻脱胶高效菌种分泌的胞外果胶复合酶进行苎麻酶法脱胶，以期获得脱胶效果优良的果胶复合酶，为脱胶酶制剂制备提供科学依据。

1 实验部分

1.1 实验材料

菌 种：8种苎麻脱胶菌种(组号分别为11、21、32、12、22、31、G和N)，均为中国农业科学院农产品加工微生物菌种保藏库保存。

苎麻原料：苎麻原麻(中苎1号)由中国农业科学院麻类研究所苎麻育种研究室提供。

培养基：肉汤改良培养基，1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.5%牛肉膏和0.5% NaCl。发酵培养基：1.5%蛋白胨、0.2%酵母膏、0.3%牛肉膏、0.4% NaCl、0.05% MgSO4和0.05% KH2PO4。果胶选择培养基：0.5%橘子果胶、0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1% NaCl和2%琼脂粉。

主要试剂：魔芋胶，成都路特生物公司；桦木木聚糖、羧甲基纤维素钠盐(CMC·Na)、橘子果胶和聚半乳糖醛酸钠(PGA·Na)，美国Sigma公司；其他常规试剂，国药集团。

1.2 主要仪器设备

Vivaflow小型超滤装置，德国Sartorius公司；SH-5000M电子显微镜，日本Hirox公司；酶标仪，美国Thermo Scientific公司；高压灭菌锅，中国致微仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 果胶复合酶液的制备

从菌种库保藏的斜面挑取一环菌种接种至试管液(5 mL肉汤改良培养基)，充分混匀，在生化培养箱35 ℃培养5～6 h。稀释涂果胶选择培养基平板，35 ℃倒置培养18～20 h，获得单菌落。挑选透明圈大的菌落接种于试管液，35 ℃，180 r/min培养6～7 h。按2%接种量接种于发酵培养基，35 ℃，180 r/min培养9～10 h，获得成熟发酵液。取成熟发酵液，用孔径为0.2 μm的膜包进行超滤，滤过液即为果胶复合酶原液。

1.3.2 果胶酶活力的测定

参照Roy方法进行[8]。用pH值为9.0，浓度为 0.05 mol/L 的Gly-NaOH缓冲液配制5 g/L PGA·Na溶液。取1 mL适当稀释倍数的酶液加入到2 mL预热的底物中，再添加6 μL 1 mol/L CaCl2溶液，立即混匀，45 ℃条件下准确反应20 min后，终止酶活。用充分灭活的酶液，作相同反应处理的溶液作对照，在235 nm波长下测定光吸收值(OD)。果胶酶活力定义为：底物每分钟释放出相当于1 μmol不饱和半乳糖醛酸酐所需的酶量为1个酶活力单位(以IU表示)，235 nm波长下消光系数为4 600。

1.3.3 半纤维素酶活力的测定

采用DNS法测定木聚糖酶活力和甘露聚糖酶活力[9]。

1.3.4 纤维素酶活力的测定

以CMC·Na为底物，用DNS法测定纤维素酶活力[10]。

1.3.5 蛋白质含量测定

以牛血清白蛋白作为标准蛋白，采用BCA法测定蛋白质含量[11]。

1.3.6 苎麻酶法脱胶工艺

准确称取无壳苎麻20 g于500 mL摇瓶。将复合果胶酶原液与自来水按1∶1 000稀释，添加终浓度为1 mmol/L的CaCl2，调节温度至45 ℃。取200 mL稀释的果胶复合酶液浸泡苎麻，即苎麻与果胶复合酶稀释液的浴比为1∶10。45 ℃条件下，90 r/min振荡反应4 h后，105 ℃灭活20 min终止脱胶。1.3.7 酶法脱胶综合指标的测定

纤维形态学观察：取苎麻原麻和酶法脱胶后的苎麻纤维，喷金处理后，用扫描电子显微镜观察其纤维纵截面的表面形貌。

还原糖含量测定：采用DNS法测定还原糖的光吸收值OD540，用葡萄糖做标准曲线，换算还原糖含量。

质量损失率测定：设原料麻的质量为Gm，发酵麻的质量为Gf，质量损失率(w)的计算公式[12]为

残胶率测定：参照GB 5889—1986《苎麻化学成分定量分析方法》进行测定。

2 结果与讨论

2.1 果胶复合酶中关键酶活力分析

2.1.1 果胶酶活力分析

表1示出各复合酶原液中中果胶酶活力。由表可看出：第N组的果胶酶活力最高达61.79 IU/mL，比酶活力为4.47 IU/mg；第G组的果胶酶活力为13.69 IU/mL，比酶活力为0.93 IU/mg，因此，第N组和第G组的果胶酶具有明显优势。

表1 各复合酶原液中的果胶酶活力比较

2.1.2 半纤维素酶和纤维素酶活力分析

表2示出各复合酶液原液中的半纤维素酶活力和纤维素酶活力。由表可看出：第N组的甘露聚糖酶活力和木聚糖酶活力具有明显优势，并且其纤维素酶活力仅为0.01 IU/mL。

2.2 酶法脱胶综合指标分析

2.2.1 形态学特征

表3示出酶法脱胶后的苎麻外观形态定性分析。由表可看出：第N组果胶复合酶处理后的苎麻纤维无论在柔软程度、纤维分散程度还是纤维洁白度上都显示出最佳效果，预示着其为苎麻脱胶最佳酶组。

表2 半纤维素酶和纤维素酶活力比较

表3 酶法脱胶后的苎麻外观形态

注：“+”越多，表明苎麻纤维越柔软、越分散、越洁白，脱胶效果越好。

图1示出第N组酶法脱胶前后的苎麻纤维表面形貌。由图可看出：与苎麻原麻相比，脱胶后的苎麻纤维分散，且表面光滑。

图1 脱胶前后苎麻纤维的SEM照片Fig.1 Pre-degummed and bio-degummed ramie photoes taken by electron microscope. (a) Ramie material; (b) Ramie fiber bio-degummed

2.2.2 还原糖含量分析

图2示出发酵液的还原糖含量变化规律。由图可看出：第N组果胶复合酶处理后的苎麻脱胶液中还原糖含量最高为0.121 mg/mL，其次为第G组(0.113 mg/mL)，依次减少的组号为32、31、21、12、22和11。

图2 苎麻脱胶液的还原糖含量Fig.2 Reducing sugar content in the liquid of ramie degummed

2.2.3 质量损失率与残胶率比较

表4示出各组苎麻脱胶的质量损失率和残胶率。由表可看出，第N组的质量损失率最高，达20.30%，残胶率仅2.52%；其次第G组的质量损失率为18.69%，残胶率为4.21%。第N组和第G组的苎麻胶质去除效果具有明显优势，并且接近现有报道的高效菌种[13-15]。

表4 苎麻质量损失率与残胶率比较

2.2.4 纤维特征参数比较

表5示出各组脱胶苎麻的重要纤维特征参数，由表可看出，第N组的单纤维线密度为5.31 dtex；束纤维断裂强度为4.8 cN/dtex，属于优质脱胶苎麻纤维[16]。

表5 脱胶苎麻的纤维特征参数比较

3 结 语

通过比较苎麻脱胶菌种分泌的胞外酶中的果胶酶活力，获得了2组优势果胶复合酶，最高果胶酶活力分别为13.69、61.79 IU/mL；通过苎麻酶法脱胶实验发现，第N组的苎麻酶法脱胶效果最佳，其次为第G组。从这2组苎麻的质量损失率、残胶率及纤维的特征参数来看，均接近现有苎麻脱胶的实际应用效果，值得进一步研究。

FZXB

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Screening on compound pectinase for ramie degumming and its effect analysis

CHENG Lifeng1, LIU Zhengchu1, FENG Xiangyuan1, WANG Qiming2, LI Qi1,3, ZHENG Ke1, YANG Qi1, DUAN Shengwen1

(1.InstituteofBastFiberCrops,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Changsha,Hunan410205,China; 2.CollegeofLifeScience,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 3.HunanLerkamBiologyCo.,Ltd.,Yueyang,Hunan414100,China)

To develop efficient enzyme preparation used in ramie degumming, the efficient strains used in ramie bio-degumming subjected to liquid state fermentation, which were screened and accessed. The characteristic parameters of extracellular enzymes including pectinase activity, mannanase activity and protein content, etc. were further determined, and the comprehensive indexes of the ramie degumming system, such as fiber morphology, mass loss rate, residual gum rate, etc., were analyzed. The results show that pectinase activities of the group N and the group G were 61.79 IU/mL and 13.69 IU/mL, respectively, and their special enzyme activities were 4.47 IU/mg and 0.93 IU/mg, respectively. Cellulase activities of the group N and the group G were only 0.01 IU/mL and 0.02 IU/mL, respectively. Their mass loss rate and residual gum rate of the group N and the group G were 20.30% and 18.69%, and 2.52% and 4.21%, respectively, which are close to those of strains in practical industry application. The single fiber fineness of the group N was 5.31 dtex, and the fracture strength of the bundle fiber was 4.8 cN/dtex, which belonged to high-quality degummed ramie fiber.

ramie; degumming; pectinase; hemi-cellulose; fiber morphology

10.13475/j.fzxb.20160601505

2016-06-07

2017-03-08

湖南省自然科学基金项目(2016jj3126)；中国农业科学院创新工程(ASTIP-IBFC08)；国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-19-E24)；中国农业科学院基本科研业务费专项(Y2016PT36)；湖南省战略性新兴产业科技攻关和重大科技成果转化项目(2014GK1041)

成莉凤(1981—)，女，助理研究员，博士。主要研究微生物基因工程等。段盛文，通信作者，E-mail：hunandsw@163.com。

TS 121； TS 123.2

A