儿童急性横贯性脊髓炎患儿脑脊液中miR—182—5p上调促进CREB蛋白表达的实验研究

王志杰+郭晓玲+刘海英+王天仪+李焕龙+张铮+周搏+门秀丽

【摘要】 目的 从微小RNA（microRNA）组学角度探索儿童急性横贯性脊髓炎（ATM）发生的分子生物学机制， 以期寻找关键治疗靶点。方法 使用microarray4.0芯片检测儿童急性横贯性脊髓炎患儿脑脊液中发生改变的microRNA， 运用生物信息学方法论证发挥关键调控作用的microRNA， 进行靶基因预测。运用反转录荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术进行生物学与技术重复。检测关键microRNA靶蛋白的表达量并分析样本间靶蛋白与目标microRNA表达变化趋势相关性。结果 急性横贯性脊髓炎患儿脑脊液样本中共有247个microRNA发生表达变化， microRNA-182-5p（miR-182-5p）特征性上调明显。生物信息分析结果显示cAMP 应答元件结合蛋白 （CREB）可为miR-182-5p的靶基因， 与miR-182-5p趋势相反。结论 儿童急性横贯性脊髓炎脑脊液中miR-182-5p上调导致CREB下调， 使神经元轴突生长能力下降。miR-182-5p是儿童急性横贯性脊髓炎治疗的关键靶点之一。

【关键词】 儿童急性横贯性脊髓炎；脑脊液；微小RNA；cAMP 应答元件结合蛋白 ；治疗靶点

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.16.029

急性横贯性脊髓炎（acute transverse myelitis， ATM）属于横贯性脊髓炎（transverse myelitis， TM）疾病的炎症亚型。在急性期与亚急性期可以损伤脊髓产生临床症状， 进而导致神经传导功能的缺陷。至今为止绝大部分急性横贯性脊髓炎患儿的发病机制依然难以明确， 儿童时期是急性横贯性脊髓炎患儿发病率较高的两个阶段之一。cAMP 应答元件结合蛋白 （cAMP response element binding protein， CREB）与学习记忆、神经退行性疾病以及促进神经细胞分化、维持突触功能和促进再生有关[1-3]。有学者报道， 神经细胞中CREB的表达能克服髓磷脂抑制促进损伤的脊髓后索再生[4-6]。本研究首先应用microarray方法在microRNA组学（miRNomes）角度观察急性横贯性脊髓炎样本中microRNA的表达改变， 进而寻找关键microRNA以及它的靶基因、靶蛋白。

1 材料与方法

1. 1 样本采集 本研究收录承德医学院附属医院、中国人民解放军第二六六医院2016年1～9月诊断为急性横贯性脊髓炎的4例患儿， 家属签署知情同意书后， 取脑脊液样本随机编号为T1～T4冻存。对照组脑脊液样本来自临床怀疑相关疾病， 经脑脊液等相关检查排除疾病， 脑脊液为正常者3例患儿， 家属签署知情同意书后， 取脑脊液样本冻存。

纳入标准：①ATM组：按照TMCWG诊断标准（横贯性脊髓炎联盟工作组织于2002年提出的公共诊断标准）诊断为ATM者， 且无其他疾病。②对照组：临床怀疑相关疾病， 经脑脊液等相关检查排除疾病， 脑脊液为正常者。

排除标准：有遗传性疾病家族史者；近期曾患感染性疾病者；营养不良、生长发育状态欠佳者；有结核病史者。

1. 2 总RNA抽提 采用mirVanaTM PARISTM Kit试剂盒（Ambion， 美国）按照说明书操作， 具体如下：每例样本采集脑脊液2 ml， 迅速转入抗凝管中用移液器混匀。在1 h内（室温条件下）进行下面的操作：820 g， 4℃， 离心10 min。吸取1 ml上清转至干净的1.5 ml离心管中， 16000 g， 4℃， 离心10 min。小心吸取上清到新的離心管中， 置于-80℃保存备用。取适量的样本400 ?l， 加入等量的2×Denaturing Solution， 涡旋混匀， 冰上放置5 min。加入等体积的氯仿， 涡旋混匀30～60 s， 室温， 最高转速离心5 min。小心吸取上清到新的1.5 ml离心管中， 添加1.25倍体积的无水乙醇， 涡旋混匀。转移至柱子中（最大体积700 ?l），13000 g， 离心30 s。加入350 ?l microRNA Wash Solution 1到离心柱中， 13000 g， 室温离心15 s， 弃流过液， 将离心柱重新放置到收集管中。混合10 ?l DNase I和 70 ?l Buffer RDD QIAGEN总体积80 ?l， 加到离心柱中的膜上， 室温放置15 min。加入350 ?l microRNA Wash Solution 1到离心柱中， 13000 g， 室温离心15 s， 弃流过液， 将离心柱重新放置到收集管中。加入500 ?l Wash Solution 2/3过柱2次， 空柱离心1 min。将离心柱放置到新的收集管中， 柱中心加100 ?l 95℃预热的Elution Solution， 室温最高转速离心20～30 s， 收集管中的液体即为提取的Total RNA， 放置在-70℃保存。

1. 3 microRNA表达谱的数据分析 本实验应用microRNA 4.0芯片（Affymetrix， 美国）。利用NanoDrop ND-2100（Thermo Scientific， 美国）定量总RNA并用Agilent 2100（Agilent， 美国）检测RNA完整性。质检合格后， 参照芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。利用Affymetrix Scanner 3000（Affymetrix， 美国）扫描得到原始图像。应用Expression Console version1.3.1（Affymetrix， 美国）数据分析软件分析图像， 将所得原始数据转化为RMA标准化算法信号值， 并应用分层聚类分析的方法对样本间microRNA表达模式进行分析。

1. 4 RT-qPCR 利用miScript II Reverse Transcription Kit （Qiagen， 德国） 和PrimerScript RT reagent Kit （TaKaRa， 日本）分别进行microRNA和mRNA的检测。分别用U6 和 GADPH对所得的microRNA和mRNA表达量进行标准化。

1. 5 酶聯免疫吸附测定（ELISA） 采用美国R&D System公司生产的试剂盒进行检测， 所有操作严格按照说明书进行。

2 结果

2. 1 儿童急性横贯性脊髓炎microRNA表达谱分析 芯片结果显示， 与对照组相比急性横贯性脊髓炎样本中共有247个microRNA发生表达变化（见图1）。其中miR-182-5p在各样本中明显上调， 与对照组相比分别上调3.61、5.93、4.28及3.74倍， 这4个上调倍数在各样本上调倍数排序中分别位于第5、4、7、6位。这就使得miR-182-5p初步纳入研究者的视线。用RT-qPCR验证芯片miR-182-5p相关数据， 结果显示具有良好的一致性（见图2）。

2. 2 靶基因预测 为了进一步研究miR-182-5p表达变化的意义， 本研究应用Target Scan数据库预测miR-182-5p的靶基因， 并查询相关文献发现其靶基因可为CREB（见表1）。

2. 3 CREB蛋白的表达量与变化趋势 用ELISA检测各样本CREB蛋白的表达量（见表2）， 比较发现CREB蛋白与miR-182-5p的表达趋势相反（见图3）。进一步说明了CREB是miR-182-5p的靶基因。

3 讨论

miR-182-5p上调是影响急性横贯性脊髓炎临床特点的重要因素之一；miR-182-5p通过调节其靶基因CREB从而进一步影响神经元轴突的生长。急性横贯性脊髓炎样本中， 至少发生一次改变的microRNA一共有247个， 经KEGG数据库生物信息分析这些microRNA涉及多条细胞信号转导通路[7-9]。miR-182-5p只是诸多发挥调控作用的重要microRNA之一。本团队期待在未来实验中可以进一步探索其他关键调控microRNA以期更客观、全面、深入探究急性横贯性脊髓炎发病机理， 为临床应用找到更多且更加有效的治疗靶点。

参考文献

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