低氧后处理活化腺苷A2a受体抑制皮瓣微血管内皮细胞凋亡

曾建坤　林煌　李斌斌等

[摘要]目的：本研究致力于探求腺苷A_2a在低氧后处理抗凋亡中的作用。方法：從人上睑皮肤组织中分离培养原代人皮肤微血管内皮细胞，经6h低氧培养后，置于正常氧环境培养12h；或者经过5min常氧/5min低氧，3次循环，即低氧后处理，之后再常氧培养11.5h。结果：细胞凋亡比例和细胞凋亡相关蛋白（Bax/Bcl-2和caspase-3）表达量增高，均证明低氧/复氧可引起严重的损伤（P<0.05）。低氧后处理和选择性A_2a受体激动剂——CGS-21680均可降低前两者（P<0.05）。同时，低氧后处理和CGS-21680均明显活化了腺苷A_2a受体（P<0.05）。数据分析显示，凋亡的增加量与A_2a受体蛋白的表达增加量呈显著负相关（r2=0.8177，P<0.0001）。结论：低氧后处理通过活化皮肤微血管内皮细胞表面的A_2a受体发挥抑制凋亡的作用。

[关键词]游离皮瓣；人皮肤微血管内皮细胞；凋亡；低氧后处理；腺苷A_2a受体

[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0070-04

游离皮瓣移植被广泛用来进行器官再造或覆盖大面积的组织缺损。手术过程中缺血再灌注不可避免地造成游离皮瓣损伤。Eltzschig研究发现，缺血再灌注可以导致血管内皮细胞凋亡。Bax作为一种促凋亡因子，促进细胞色素C从线粒体释放。细胞色素C进入胞质，活化caspase-9，后者又激活caspase-3，启动凋亡程序。抗凋亡因子Bcl-2能够抑制Bax的活化和细胞色素C的释放，从而抑制凋亡。研究显示，Bax/Bcl-2比值增加可以反映caspase体系的活化程度，后者在凋亡程序中出于核心地位。

2003年，Zhao等人在试验中采用缺血后处理减轻了缺血再灌注引起的急性心梗面积。Moon首次报道了缺血后处理有效减轻了兔皮瓣的再灌注损伤，这一研究将缺血后处理的应用推广到符合组织。

2007年证实，缺血后处理的抗再灌注损伤作用与心脏的腺苷A_2a受体活化有关。一系列关于缺血后处理的广泛研究促进了针对细胞的类似保护措施——低氧后处理的出现。

我们推测低氧后处理通过活化微血管内皮细胞的腺苷A_2a受体抑制凋亡。本研究采用我们团队之前报道过的人皮肤微血管内皮细胞模型，低氧/复氧和低氧后处理分别模拟游离皮瓣移植过程中的缺血/再灌注和缺血后处理。本研究的目的是：①探究低氧后处理是否能够抗皮肤微血管内皮细胞凋亡；②观察不同分组的A_2a受体表达水平是否有变化，如果有变化；③研究受体活化与凋亡之间的关系。

1材料和方法

1.1材料：原代人皮肤微血管内皮细胞，实验采用的人皮肤微血管内皮细胞来自重睑术后切除的上睑皮肤组织；CD31 MicroBeads Kit（Miltenyi Biotec，Macs，Germany）；CGS-21680（Abcam，Cambridge，England）；FITC-Annexin V凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences，BD Pharmingen^TM，USA）；抗兔Bax抗体，抗兔Bcl-2抗体，抗兔caspase-3抗体，碱性磷酸酶的羊抗兔IgG以及GAPDH（Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，USA）。

1.2方法

1.2.1实验分组处理：细胞随机分为4组，分别进行如下处理：①对照组（CON）：细胞于常氧完全培养基内培养18h；②低氧/复氧组（H/R）：细胞在含90%N₂+5%CO₂+5%O₂的低氧培养箱中培养6h（低氧），之后在正常氧含量的培养基中培养12h（复氧）；③低氧后处理组（HPC）：低氧6h结束之后，细胞立即转移至常氧环境5min，结束后马上转回低氧培养箱5min，执行3个循环后再常氧培养11.5hin：；④H/R+CGS-21680组（H+C）：低氧和复氧前分别向培养基内加入1μM CGS-21680，其他处理同H/R组。

1.2.2免疫荧光染色检测A_2a受体：复氧结束后，经福尔马林固定过的细胞用0.1%Triton X-100通透15min，再用3%牛血清白蛋白室温封闭30min。抗腺苷A_2a抗体按1：100稀释后湿盒内4℃孵育过夜。PBST洗涤，1：200稀释后二抗室温孵育。最后DAPI染核，封片。激光共聚焦扫描显微镜下观察凋亡细胞。

1.2.3流式细胞分析术检测凋亡比例：使用FITC-AnnexinV凋亡检测试剂盒Ⅰ检测细胞的凋亡比例。冷PBS洗涤细胞2次后胰蛋白酶处理。FBS终止胰蛋白酶消化作用。218g离心5min。1X结合缓冲液重悬沉淀至1×106细胞/ml。每100μl液体内加入5μl 0f Annexin V FITC和5μl PI。室温避光孵育15min。流式上机前加入200μl的1X结合缓冲液。另设两组分别不加Annexin V FITC或PI，以调整流式细胞仪。

1.2.4蛋白免疫印迹每组处理结束，冷PBS洗涤细胞三次。每孔加入浓度为含150ml/1蛋白酶抑制剂的细胞裂解液。收集细胞后4℃离心15min。用试剂盒定量蛋白，调整蛋白浓度。蛋白样品煮沸5min，每孔上样25μg蛋白。将靶蛋白转移至硝酸纤维素膜。用以下稀释的一抗孵育：抗兔Bax，抗兔Bcl-2，抗兔caspase-3以及GAPDH。二抗为碱性磷酸酶的羊抗兔IgG。Odyssey成像系统扫膜。

1.3统计分析：数据均采用x±s方式表示。单因素方差分析方法进行组间比较。Student-Newman-Keuls q test进行组内比较。统计分析使用SPSS19.0软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。P<0.05被认为具有统计学差异。

2结果

2.1低氧/复氧后行低氧后处理或CGS-21680处理，均能减少凋亡：如圖1，流式细胞分析结果显示低氧/复氧组凋亡比例显著高于对照组（27.76%±1.38%vs0.90%±0.31%，P<0.05），而低氧后处理组和H+C组凋亡比例分别降至16.47%±0.60%.7.63%±0.83%（P<0.05）。

为验证低氧后处理是否具有抗凋亡效应，采用蛋白免疫印迹检测Bax和Bcl-2的表达量。（图2A、B）。与流式分析结果一致，低氧后处理和CGS-21680处理均降低了Bax/Bcl-2比值（图2C）以及caspase-3表达量（图2D），从而发挥抗凋亡效应。

2.2低氧/复氧后行低氧后处理或CGS-21680处理，均促进了A_2a受体表达：为进一步探究A_2a受体与凋亡相关因子的关系，我们检测了各组中受体的表达量（图3）。蛋白免疫印迹结果显示，与H/R组（7.12±0.57）相比，HPC组和H+C组受体表达量分别增长至11.98±0.70（P<0.05）和16.46±2.47（P<0.05）。

2.3细胞凋亡与A_2a受体蛋白表达的关系：鉴于低氧后处理与腺苷A_2a受体激动剂对细胞凋亡和A_2a受体表达量的相似影响，我们假说：低氧后处理可能通过活化A_2a受体从而抑制细胞凋亡。以CON组为基准，我们计算了其余三组A_2a受体表达增加量和凋亡比例的减少量，并用Pearson相关计算两变化量之间的关系。如图4所示，凋亡比例增加量与A_2a受体表达相对增量呈密切的负相关关系（72=0.8177，P<0.0001），说明低氧后处理减轻低氧/复氧引起的细胞凋亡，至少部分原因是因为A_2a受体活化。

3讨论

本研究证明低氧后处理减少人皮肤微血管内皮细胞凋亡比例和线粒体途径细胞凋亡相关蛋白的表达，从而减轻复氧导致的损伤。此外，我们进一步证实低氧后处理抑制凋亡至少部分是通过活化A_2a受体实现的。

3.1缺血/再灌注经线粒体途径导致皮肤微血管内皮细胞凋亡：凋亡的确切机制相当复杂，包括一系列能量依赖的分子事件。目前研究发现主要有两条信号通路：死亡受体途径和线粒体途径。线粒体途径起始于Bcl-2凋亡调节家族，如Bax和Bcl-2。本研究中，我们检测了Bax/Bcl-2比值和caspase-3来反应凋亡。蛋白免疫印迹显示，与CON组相比，低氧/复氧导致Bax/Bcl-2比值升高，caspase-3表达增多，即导致了更为严重的凋亡。流式细胞分析也显示出了同样的趋势。之前有报道缺血再灌注可导致组织和器官的血管内皮细胞凋亡。我们的研究结果与之相同。

3.2腺苷A_2a受体介导线粒体途径细胞凋亡：以往研究证实，内皮细胞在心肌缺血损伤的始动和进展中具有核心作用。因此，减轻血管内皮细胞损伤在保护游离皮瓣的缺血再灌注损伤中具有重要作用。已有许多研究致力于减轻缺血再灌注引起的内皮细胞凋亡，目前，腺苷成为新的研究热点。腺苷是腺嘌呤核苷酸的中间产物，当供氧减少或能量消耗增加时可作为一种活性物质。内皮细胞中腺苷代谢非常活跃，具有强大的吸收和释放核苷的能力，在机体缺血时可以作为重要的腺苷来源。反之，腺苷也能通过活化内皮细胞的膜受体调节内皮细胞的功能。腺苷受体属于G蛋白偶联7跨膜受体，包括A₁，A_2a，A_2b和A₃亚型。最近，有研究者已经确认药物或疾病诱导的凋亡与腺苷A^2a受体的关系。2013年，Soleimani报道A_2a受体经线粒体途径在凋亡过程中起作用。与之类似，Huang也报道了A_2a受体与线粒体依赖的细胞凋亡相关。但是不同来源的内皮细胞具有不同的生物学特征，迄今未有人皮肤微血管内皮细胞与A_2a受体关系的报道。本研究检测了A_2a受体蛋白的相对表达量，探究不同组间表达是否有差异。

3.3低氧后处理通过活化腺苷A_2a受体减轻缺血再灌注损伤：我们团队之前已经报道了体外构建人皮肤微血管内皮细胞的低氧后处理模型，为研究血管内皮细胞凋亡与低氧后处理的关系提供了模型基础。研究中，我们确定了后处理的流程：5min低氧/5min复氧，共3次循环。不同于Wang报道的5min低氧/5min复氧，共2次循环。可能是因为细胞部位、来源、培养环境不同所致。本研究中，低氧/复氧显著提高了凋亡比例，低氧后处理又可减轻凋亡比例，证实了低氧后处理在人皮肤微血管内皮细胞的抗凋亡作用。研究结果与Vetrovoi报道的结果相同，他报道低氧后处理过程中涉及凋亡相关进程。

大量关于低氧后处理抗凋亡分子机制的研究已取得重大进展。2009年，Leconte证实了低氧可保护神经元细胞，并指出HIF-1α所起的作用。此外，Wang发现低氧后处理通过减少ON00^-的形成减轻心肌细胞凋亡。然而，至今没有被学术界公认的统一理论。

本研究着重关注A_2a受体活化与低氧后处理的关系。蛋白免疫标记结果显示，与H/R组相比，HPC组与H+C组A_2a受体活化显著增加。并且统计分析证实凋亡比例增加量与A_2a受体表达相对增量呈密切的负相关关系。综上，A_2a受体活化至少是低氧后处理起保护作用的原因之一。

4结论

与H/R组相比，低氧后处理降低了凋亡比例，活化了A_2a受体，同时改变了线粒体途径凋亡相关蛋白的表达，使Bax/Bcl-2比值减小，caspase-3表达减少。我们得出结论：低氧后处理激活A_2a受体，经线粒体凋亡途径减轻低氧/复氧引起的细胞凋亡。本研究将为低氧后处理抗凋亡机制研究提供了新的视角，为整形外科提高游离皮瓣移植成活率创造了理论基础。