街头采血应用胶体金标法快速检测HBsAg漏检原因分析

何卫社 刘乐霞 王德平 李国荣 冯丽娜 张燕

杨茂 邓晓琴 田智 杨永红 薛薇

街头采血应用胶体金标法快速检测HBsAg漏检原因分析

何卫社 刘乐霞 王德平 李国荣 冯丽娜 张燕

目的 分析胶体金标法快速检测HBsAg漏检原因，以采取措施减少因HBsAg漏检造成的血液报废。方法 采用胶体金标法复检ELISA试剂检测出的HBsAg阳性标本，分析复检情况，并对两种方法进行比较。结果 对57 480份标本采用两种ELISA试剂检测出HBsAg阳性标本319份，街头HBsAg阳性漏检率为0.55%；胶体金标法复核319份标本，阳性158份，占总漏检标本的49.5%；ELISA法阳性检出率与胶体金标法比较差异有统计学意义（P＜0.001）。结论 街头采血应用胶体金标法漏检HBsAg的主要原因是方法学限制和人为因素，血站应加强员工岗位技能、责任心的培训，制定质量目标，定期考核监督，奖惩并进，降低漏检造成的血液报废。

街头采血 胶体金标法 HBsAg 漏检

我国是乙型肝炎高度流行区，一般人群HBsAg携带率约9.09 %[1]。血站采用胶体金标法快速检测HBsAg对降低街头采血的报废率至关重要，但在快速筛查时仍会出现HBsAg 阳性漏检。现就血站街头采血应用胶体金标法快速检测HBsAg的漏检原因进行分析。

材料与方法

1 材料 胶体金标法快速检测HBsAg阴性的街头无偿献血者标本57 480人份。

2 仪器 AE380全自动酶免分析仪；EVO全自动一次性针加样仪；FAMA24/20 后处理系统。

3 试剂 英科新创科技有限公司提供的乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂（胶体金法），出厂及进站质量抽检均合格，在有效期内使用；ELISA试剂盒分别由索灵诊断医疗设备有限公司和珠海丽珠试剂股份有限公司提供，中国食品药品检定研究院批批检和进站质量抽检均合格，在有效期内使用。

4 方法 严格按试剂说明书操作。对57 480份标本经两种ELISA试剂检测阳性的标本，采用胶体金标法进行复测，记录ELISA试剂S/CO值、胶体金标法检测结果以及阳性标本检测线出现时间。

5 统计学处理 应用SPSS16.0软件包，计数资料采用χ2检验。

结果

1 57 480份标本用两种ELISA试剂检测出HBsAg阳性标本319份，街头HBsAg阳性漏检率为0.55%；

2 采用胶体金标法复核319份标本，阳性158份，占总漏检标本的49.5%。10 min内检出阳性结果150份，占总漏检标本的47.0%，检测线出现清晰的红色，S/CO值均在27以上；10 min以后出现阳性结果的8份，检测线出现淡淡的红色，S/CO值在10~25；胶体金标法复核阴性161份，占总漏检标本的50.5%，其中6份 S/CO值在29以上，余下S/ CO值均在1~10。

3 ELISA法阳性检出率与胶体金标法比较差异有统计学意义，χ2=88.0（P＜0.001），见表1。

表1 胶体金标法复检与ELISA检测结果比较

4 1~12月份胶体金法HBsAg漏检情况见图1，其中1~3月份和10~12月份平均漏检率分别是0.66%、0.69%，均高于其他月份。

图1 不同月份胶体金法HBsAg漏检情况

讨 论

采用胶体金标法检测HBsAg具有快速、操作简单、准确率高、无需特殊设备等优点，被广泛应用于血液采集前端筛查。血站通过献血前使用胶体金法检测HBsAg 筛选献血者后采血，HBsAg阳性率控制在0.55 %，有效降低了无偿献血采集后的大量血液报废。胶体金标法因试剂灵敏度、检测方法和人为观察误差的限制，存在一定的漏检率［2］。漏检原因主要是：①试剂本身缺陷，占漏检总数的50.5%。HBsAg胶体金标法adr、adw、ay三个亚型最低检出量不高于2.5 ng/ml（约4 IU/ ml），《中国生物制品规范》要求HBsAg ELISA法adr、adw、ay三个亚型最低检出量（IU/ml）分别不高于0.1、 0.1、 0.2，胶体金法最低检出量低于ELISA法近20~40倍，其灵敏度远远低于ELISA法，试验发现ELISA法阳性检出率与胶体金标法比较差异有统计学意义。另试剂包被片段不同或少数标本可能存在HBV变异或者亚型导致阳性标本漏检，6份 S/CO值在29以上的标本，胶体金标法复检仍为阴性，应是此原因造成的。②人为因素。责任心不足，培训不到位，尤其是新进员工的培训。试验操作未严格遵循说明书，如观察时间不足，加样不规范，加样量不足，试剂贮存不当受潮，检测多个标本时标识不到位等，影响结果的正确判断。③环境因素。试验发现1~3月份和10~12月份平均漏检率分别是0.66%、0.69%，均高于其他月份，环境温度低、湿度大，导致反应时间长，造成漏检。

通过上述漏检原因分析，血站应采取切实有效的措施降低HBsAg的漏检。①加强操作人员责任心、岗位技能培训，严格按照试剂说明书进行操作，严格控制反应时间，在温度较低情况下可以适当延长反应时间，试剂贮存注意防潮，标本和HBsAg试纸条进行唯一性标识，防张冠李戴。②根据较强阳性及强阳性的S/CO值试验数据测算本站HBsAg试剂漏检率，为采血部门制定量化考核质量目标，监管职能科室加强考核监督，定期考核奖惩并进。③改善采血车上的环境，使车上温度和湿度尽量保持在适合试剂反应的最佳状态。④做好试剂的质控把关。同时厂家也应加强试剂的改进，提高灵敏度，更适于街头采血。

有报道采用胶体金标法检测HBsAg强阳性的S/ CO值均在25以上，较强阳性的S/CO值在9~25［3］，我们试验中较强阳性及强阳性的S/CO值均在27以上，与报道不符，可能与HBsAg不同滴度的人群分布有关，也与实验室的检测系统不一样有关。建议每个血站通过摸索本血站的较强阳性及强阳性HBsAg的S/CO值，量化制定适合自己血站的街头HBsAg试剂漏检率，不要照抄照搬。阳性标本的S/CO值在10以下时，胶体金标法与ELISA法阴性标本检测结果的一致性为100%，与杨俊鸿等报道相符［3］。

1 倪语星，尚红.临床微生物学与检验[M].北京：人民卫生出版社，2007：445.

2 韩建国. HBsAg全血金标法检测漏检原因分析[J].临床输血与检验，2003，5（3）：206.

3 杨俊鸿，彭楷，刘加伟，等.单采血小板乙型肝炎病毒表面抗原快速检测的漏检分析[J].检验医学与临床，2014，11（16）：2275-2276.

（本文编辑：姚萍）

·仪器评价·

国产METIS 150全自动血型仪参数优化与性能验证

杨茂 邓晓琴 田智 杨永红 薛薇

【摘 要】 目的 对国产METIS 150全自动血型仪进行试验参数优化和性能验证。方法 用已知血型标本，分别对标本红细胞稀释法、红细胞悬液加量、试剂红细胞加量、抗-A/抗-B/抗-D稀释倍数及加量、标本血浆加量等可选参数进行预选，以结果正确率最高为依据确定优化参数；优化血型仪参数后，用已知标本对ABO定型和Rh（D）筛查结果的准确性、重复性和方法敏感性进行验证。结果 离心条件、反应温度、振荡方式、吸液、注液、洗针等六项厂家推荐参数适当；标本红细胞12 μl+300 μl盐水制备悬液，25 μl/孔红细胞悬液+25 μl抗-A、抗-B原液，正定型结果正确率可达100%；25 μl/孔红细胞悬液和1∶10稀释抗-D 25 μl/孔，Rh（D）筛查结果正确率可达100%；血浆70 μl/孔+试剂红细胞25 μl/孔，反定型结果正确率可达100%。参数优化后，ABO定型和Rh（D）筛查结果准确率达100%，4份A2B亚型定型正确，4份疑难血型提示结果疑问，1年时间检测全部献血者标本30 694份血型结果无错误。结论 参数优化后，METIS 150血型仪检测血型的结果准确可靠，可用于临床供血标本的血型检测。

【关键词】 ABO血型 Rh（D） 全自动血型仪 试验参数 性能验证

ABO血型和RH（D）血型是献血者血液检测规定项目[1]。传统的血型检测方法主要有玻板法和试管法等，近年来微板法血型检测技术应用增多。微板法结合数字成像技术研发的全自动血型仪，具有批量处理标本、敏感性高、自动化等优点，在血站实验室得到广泛应用[2，3]。全自动血型检测方法可标准化、可溯源、可防范人为差错、适合计算机管理，已被法规[4]推荐使用。目前主流的全自动血型仪多为开放系统，设备厂家仅向用户推荐部分设备使用参数，一般不提供配套试剂，用户可自选血型试剂。市售血型试剂尚未完全标准化，设备厂家无法详尽提供对于特定试剂的针对性参数。商品化血型试剂多宣称适用于各种检测方法，少有提供适合全自动血型仪使用的具体参数。这些原因使得不同用户对相同血型仪的使用体验存在较大差别，甚至有截然不同的使用评价。本文以保证全自动血型检测结果的准确性为目的，对国产METIS 150全自动血型仪进行试验参数优选和性能验证，现报告如下。

材料与方法

1 标本

1.1 预选试验标本：随机选取已知血型血液标本300份，含A型、B型、O型各90份，AB型30份，EDTA-K2抗凝，自然沉降2 h以上或1 000 r/min离心3 min，使红细胞与血浆分界清楚。

1.2 少见血型标本：已知A2B型4份，B3、A2B3、A3、AB3型各1份。

1.3 验证试验标本：待检献血者血液标本1 256份，含A型389份、B型352份、O型396份、AB型119份，其中Rh（D）阳性1 246份，初筛阴性10份。

1.4 性能验证试验标本：血型仪投入使用后1年内，检测献血者标本30 694份。

2 试剂 抗-A、抗-B由上海血液生物医药公司生产（批号20150102、20150611、20150918）；A、B、O红细胞试剂由上海血液生物医药公司生产（批号20155340、20155333、20165302、20165305、20165308、20165316、20165320、20165330、20165333）；抗-D由英国Millipore生产（批号BMH1305C、BMH1503D、BMA1302B）。

3 仪器

3.1 仪器：深圳爱康生产METIS 150全自动血型仪，配套供应12*8孔U-V底微孔试验板，一次性使用。

3.2 METIS 150血型仪工作原理：将标本血浆和标本红细胞盐水悬液自动定量分配到12*8孔U-V底试验微孔，分别加入试剂红细胞、抗-A、抗-B、抗-D试剂，经混匀、离心、再振荡混悬后，用

CCD数字成像仪扫描分析记录各孔影像。红细胞有凝集时，凝块聚拢在U-V型微孔底中央呈“细胞扣”状，无凝集则红细胞均匀分散于微孔，凝集和不凝集分别呈现不同外观，图像识别处理器根据各试验孔成像情况判断各孔凝集状况（凝集+或不凝集-），计算机综合正定型、反定型和Rh（D）凝集试验结果，报告最终血型。正、反定型结果相符，以A、B、O、AB报告，正、反定型结果不符则以血型疑问（结果？）报告。

4 方法

4.1 参数识别：试验参数分为固定参数与可优化参数，离心条件、反应温度、振荡方式、吸液、注液、洗针参数等按厂家推荐设置为固定参数。标本血浆、抗血清和试剂红细胞加量，标本红细胞稀释方法、红细胞悬液加量为可优化参数。

4.2 参数优选：根据仪器成像仪的灵敏度、最适判读的细胞凝集块直径、凝集法血型试验经验和厂家推荐，结合正交试验结果，进行试验参数预选。设置预选参数后，检测预选试验标本，选择ABO正定型、反定型和Rh（D）正确率最高的参数作为优选参数。

4.3 优选参数验证：设置优化参数后，用验证试验标本验证血型检测结果的正确率。

4.4 重复性试验：对1 256份验证试验标本和8份少见血型标本（A2B型4份，A2B3、B3、AB3、A3型各1份）随机排序，于第1、4、7天重复检测血型，记录重复检测正确率。

4.5 敏感性试验：用少见血型标本（A2B型4份，B3、A2B3、A3、AB3型各1份），随机插入验证试验标本中盲试，记录分析试验结果，验证血型仪对疑难血型检出的敏感性。

4.6 性能验证试验：设置优化参数后，统计分析1年内使用血型仪对全部献血者血液标本的血型检测结果，验证血型仪的使用性能。

5 质量控制 使用A、B、O型质控标本，检测结果符合预期认为试验有效。

6 数据分析处理 采用Excel2007进行数据分析。以血型结果正确率为评价标准，可接受标准为常规标本结果正确率100%，疑难标本（正、反定型结果不符）疑问（结果？）提示率100%。标本因素、人为因素等非仪器原因，以及与参数设置无关原因所致的错误结果，统计时不计入错误结果。

结果

1 正定型参数预选结果 据传统的正定型试验经验，抗血清原倍使用凝集反应更快（亲和力更好），凝块更大、更致密，考虑标本红细胞需用盐水稀释，反应孔中已有较多量盐水，所以预选试验时抗-A、抗-B使用原倍和1∶1、1∶5、1∶10、1∶20稀释。仪器成像仪灵敏度为最小凝集点直径1.5 mm，红细胞凝块聚拢后直径2.5~3 mm最适合成像仪判读，拟形成直径2.5~3 mm红细胞凝块，2%~4%红细胞悬液量约需25 μl，25 μl也在仪器最适分配量范围内。标本红细胞12 μl+生理盐水300 μl混匀后，取25 μl悬液分配至试验孔，分别加抗-A、抗-B原液20 μl，形成的凝集块大小、形状和致密程度最适合血型仪判读，用预选试验标本测试，凝集孔均能100%被判定为凝集（+），不凝集孔内红细胞经振荡混悬后，也能100%被正确识别为不凝集（–）。

2 反定型参数预选结果 形成直径2.5~3 mm凝集块的红细胞悬液量约需25 μl，所以选择待检血浆70 μl/孔，试剂红细胞25 μl/孔。选此参数时，红细胞凝块在微孔底部聚拢直径2.5~3 mm，可被成像仪正确识别为凝集（+），未凝集孔红细胞经振荡混悬后也可被准确识别为不凝集（–）。

3 Rh（D）参数预选结果 Rh（D）与ABO正定型同步检测可优化试验过程，缩短试验时间，所以Rh（D）选择与正定型相同的标本红细胞稀释方法和悬液加量。抗-D试剂以原倍和1∶1、1∶5、1∶10、1∶20稀释，每孔分别加10 μl、15 μl、20 μl、25 μl、30 μl，正交试验结果显示，各种稀释倍数和15 μl以上加量，Rh（D）阳性及阴性标本结果准确率均可达到100%。但试验发现抗-D过浓会因“携带污染”影响ABO定型试验结果，加量过小会影响加样精密度，所以选择1∶10稀释抗-D，每孔加25 μl。用预选试验标本对此预选参数反复测试，Rh（D）阳性和阴性标本报告正确率均达100%。

4 可优化参数预选试验结果见表1。

5 固定参数验证结果见表2，厂家推荐参数的验证结果理想，可设为固定参数。

6 参数优选结果 在预试验结果正确率100%的预选参数中，综合考虑仪器加样模块性能、分配误差、“携带污染”、最优及保险原则后，优选参数结果见表3。优选参数与厂家推荐略有不同。

6 优化参数验证结果 设置优化参数后，于第1、4、7 d对随机排序的1 256份验证试验标本和8份少见血型标本，重复检测血型，ABO正、反定型和Rh（D）检测试验结果全部正确。

7 敏感性试验结果 不同操作者对随机插入验证试验标本中的8份少见血型标本进行3次盲样检测，4份A2B检测结果均正确判为AB型，符合中国药典对A2B型的检出要求，4份特殊标本（B3、A2B3、A3、AB3型各1份）均因正、反定型结果不符判读为疑问（结果？）。

表1 可优化参数预选试验结果

表2 厂家推荐固定参数验证结果

8 性能验证试验结果 参数优选后1年内，对30 694份献血者血液标本所作ABO正、反定型和Rh（D）试验结果全部正确，取代手工检测方法后，未收到用血医院对血站出库血液血型结果错误的报告，也未发现因严重乳糜、溶血、黄疸标本导致血型检测结果错误。

表3 METIS 150参数优选结果

讨 论

准确鉴定血型是临床输血安全的基础，血站出库血液血型须100%准确，英国血液学标准委员会（BCSH）文件《血型、抗体筛查和交叉配血新技术的评价、确认和实施指南》明确要求对血型检测系统，特别是非标准化系统进行评价和确认，确认内容包括设备参数、判定参数和试剂使用相关参数等。全自动血型仪多为开放式系统，原理不尽相同，市售血型鉴定用抗血清效价和试剂红细胞浓度多有不同，但设备厂家很少就特定试剂提供针对性参数，推荐参数多为设备自身参数和使用某种试剂的粗略参数。优化设备参数，验证确认设备性能，既是法规[4，5]要求，也是质量保证的基础，许多实验室都对所用血型仪参数进行了验证和优化[2，6]。本文资料显示血型仪试验参数会影响血型结果正确率，所以，实验室应对所用血型仪进行性能验证，以结果准确为标准，优化参数设置。

国产METIS 150血型仪使用96孔U-V形底微孔板为载体，用CCD数字成像仪判断凝集反应状态，其试验原理和结果判定基础仍为传统的盐水凝集试验。红细胞上抗原与相应抗血清反应，使红细胞相互凝集形成肉眼可见的凝块，通过离心促进细胞凝集，缩短试验时间，使凝块更加致密。红细胞凝集块在微孔U-V形底部中央聚拢为“细胞扣”状小圆点，未凝集红细胞经振荡在试验孔内散开为均匀一致的混悬态，凝集和不凝集有不同的外观。凝集反应的影响因素主要有抗原抗体比例、反应时间、温度、Ph值、电解质等，相对于采用梯度微孔板作载体的自动血型仪[6]而言，METIS 150血型仪原理简单，更少受这些因素影响，不同凝集状态的图像区分度才是影响其结果准确性的重要因素，所以参数选择与其他原理血型仪[3]有所不同，本文以血型凝集试验特点和能被CCD成像仪准确识别为主要参考进行参数优选。中国药典《抗-A抗-B血型定型试剂（人血清）》[7]要求抗-A、抗-B应检出A2B和A2型，对盐水凝集试验原理的方法而言，使用原倍抗血清或减少抗血清稀释，增大血浆标本加量时，理论上更有利于凝集反应，所以本文参数优化时注重考虑减少抗血清稀释和保证红细胞量适合成像仪判定凝集状态，还充分考虑了设备性能，在仪器最适分配范围内进行标本和试剂分配，以保证分配量的准确性和精密度。METIS 150血型仪使用永久性钢针，需要注意抗-D不稀释或稀释倍数过小可能出现加样针“携带污染”影响ABO结果的现象。另外，试剂红细胞浓度一般为2%~4%，更换红细胞试剂时要考虑不同厂家或不同批号间存在的差异，应注意凝集孔中“细胞扣”大小和无凝集孔外观是否适合成像仪判读，必要时应调整试剂红细胞用量。

优选参数后，METIS 150血型仪用于献血者血液标本检测，普通血型标本ABO正、反定型和Rh（D）筛查结果正确率均达到100%，能准确检出常见亚型，正确提示疑难血型。本文结果验证确认了国产METIS 150血型仪用于临床供血标本血型检测的可行性，1年使用情况表明，前述优化参数设置适当，用METIS 150血型仪进行献血者标本血型检测能够保证质量。使用期间更换了多个批号试剂未更改参数，未发现严重乳糜、溶血、黄疸标本导致的结果错误，提示METIS 150血型仪参数适应性良好，对试剂和标本无苛刻要求。

参 考 文 献

1 GB18467-2011.献血者健康检查要求.

2 孙波，曹丹，李文超，等.自动输血检测分析系统OLYMPUS PK7300在血型试验中的参数设置[J].中国输血杂志，2010，23（S1）：126.

3 贾俊杰，王瑞，刘亚庆，等.全自动血型分析系统试验参数的评价与验证[J].中国输血杂志，2014，27（4）：354.

4 中华人民共和国卫生部.血站技术操作规程[S].2015.

5 中华人民共和国卫生部.血站实验室质量管理规范[S].

6 徐利红，喻蕾，励晓涛.Olympus PK7200血型仪血型检测可靠性探讨[J].现代中西医结合杂志，2008，17（34）：5377.

7 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：344-347.

（收稿日期：2016-11-26）

（本文编辑：姚萍）

R446.11 R512.6+2

A 【文章编号】 1671-2587（2017）03-0295-02

2016-10-22）

R457.1+1 【文献标识码】 A

1671-2587（2017）03-0297-05

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.024

065000 河北省廊坊市人民医院（何卫社，王德平）；河北省沧州市中心血站（刘乐霞，李国荣，冯丽娜，张燕）

何卫社（1966–），男，河北廊坊人，副主任技师，主要从事输血工作，（Tel）18003368990（E-mail）tianwaiyoutian8270@sina.com。

DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.025

作者单位：614000 四川省乐山市中心血站

作者简介：杨茂（1661–），男，四川乐山人，主管技师，主要从事血站管理工作，（E-mail）416161910@qq.com。

△共同第一作者，通讯作者：邓晓琴（1963–），女，主任技师，学士，从事血液检测和实验室管理，（Tel）13183630928（E-mail）1030033968@qq.com。