肺腺癌EZH2蛋白的表达及其与表皮生长因子受体突变的关系

王玉欣，赵天淼，包 芳，韩艳华，孔丽丽，孙 梅



肺腺癌EZH2蛋白的表达及其与表皮生长因子受体突变的关系

王玉欣1，赵天淼2，包 芳3，韩艳华4，孔丽丽5，孙 梅5

目的 分析肺腺癌中EZH2蛋白的表达，寻找更有效的肺腺癌治疗方法和为降低表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制药(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐药性提供理论依据。方法 免疫组织化学染色方法检测肺组织中EZH2蛋白表达情况，实时荧光PCR法检测肺腺癌EGFR基因突变状况。比较EZH2蛋白在腺癌、正常肺组织和肺良性病变组织中的表达差异，分析EZH2的表达与EGFR基因突变的相关性。结果 EZH2在腺癌组织中的表达率(84.00%)明显高于正常肺组织(12.00%)和肺良性病变组织(11.11%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。腺癌中EZH2的表达程度与患者的性别、年龄无关；与肿瘤的大小，组织学亚型及T分期有关(P<0.05)；与EGFR基因突变无关。结论 EZH2可能参与肺腺癌的发生发展，其表达与EGFR基因突变无关，有可能成为肺腺癌治疗的新靶点。

肺腺癌；EZH2；EGFR突变

肺癌已成为威胁人类健康的一种严重疾病，随着环境污染的加重，肺癌的发病率还会继续增加。80%以上的肺癌是非小细胞肺癌[1]，其中腺癌占大多数。由于诊疗技术的不断提高，特别是靶向药物的应用，如表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制药(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)，肺癌患者的生存率已明显提高[2]，但是这类药物仅适用于EGFR突变敏感的患者，而且很快出现耐药性，所以开发新的靶向药物和克服EGFR-TKIs耐药性成为目前肺癌研究的热点。果蝇Zest基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是一种组蛋白甲基转移酶，可使组蛋白H3第27位赖氨酸残基发生甲基化[3]，引起下游上百种基因表达的沉默[4]。它在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，有可能成为肿瘤治疗的潜在分子靶点。但EZH2在肺腺癌发生发展中的作用及其与EGFR基因突变关系的研究鲜见报道。

本实验应用免疫组织化学染色方法检测肺组织中EZH2蛋白表达情况，应用实时荧光PCR法检测肺腺癌EGFR基因突变状况，并分析肺腺癌中EZH2蛋白表达的意义及其与EGFR基因突变的关系，为研发新的靶向药物和降低EGFR-TKIs耐药性提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 收集武警吉林总队医院和吉林大学二院2013-10至2015-10根治性手术切除肺腺癌标本50例。男21例，女29例。年龄35～79岁，平均59.36岁。肿瘤直径0.5～7 cm，平均2.81 cm。其中贴壁样生长为主型4例，腺泡样为主型29例，实体性为主型11例，乳头状为主型2例，黏液腺癌4例。T1期16例，T2期33例，T3期1例。有淋巴结转移者14例，无转移者36例。正常肺组织为距癌肿3 cm以上的非癌组织。另取18例肺良性病变组织作为对照，其中支气管扩张3例，肺结核4例，肺大疱5例，炎性病变6例。所有病例均经两位病理医师复诊确认。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学染色 采用PV-9002两步法，试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。蜡块常规切片脱蜡，枸橼酸盐溶液电磁炉加热修复，H2O2阻断，滴加EZH2抗体(CST公司，1∶150)，4 ℃过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木精复染显微镜下观察。PBS代替第一抗体作为阴性对照，用胎盘绒毛组织作为阳性对照。

1.2.2 染色结果判断 染色结果以染色强度和阳性细胞百分比综合计分作定性分析。染色强度分为：无色0分，浅黄色1分，黄色2分，棕褐色3分。每例随机观察5个高倍视野(400×)，每个视野计数100个细胞。阴性为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。上述两项分值相乘所得积进行评分，0～1分为阴性，2分以上为阳性。EZH2位于细胞核，呈棕黄色。

1.2.3 EGFR基因突变检测 采用罗氏CobasEGFR等位基因突变特异性扩增实时荧光定量PCR法。试剂盒均购于罗氏生物技术有限公司，蜡块切卷片5～7片放入EP管中，脱蜡烘干，按照CobasDNA样品制备试剂盒说明书提取DNA，按照CobasEGFR基因突变检测试剂盒说明书配制PCR反应体系，应用Cobasz480实时荧光定量PCR分析仪进行EGFR等位基因特异性扩增与检测，将自动检测出EGFR基因突变状况和突变类型。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件，定性资料的组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验，EZH2表达和EGFR突变的关系用Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EZH2在人正常肺组织、肺良性病变和肺腺癌中的表达 EZH2在腺癌组织中的表达明显高于正常肺组织和肺良性病变，差异有统计学意义(P<0.05)，但在正常肺组织和肺良性病变组织中的表达无统计学差异(图1，表1)。

图1 EZH2蛋白在肺组织中的表达(免疫组织化学染色，200×)

A.正常肺组织；B.肺大疱；C.肺炎性病变；D.贴壁样生长为主型；E.腺泡样生长为主型；F.实体性生长为主型；G.乳头状生长为主型；H.黏液腺癌

表1 EZH2蛋白在人正常肺组织、肺良性病变和肺腺癌中的表达

2.2 EZH2蛋白在肺腺癌不同亚型中的表达 EZH2蛋白表达在肺腺癌不同亚型之间差异有统计学意义(P=0.007)，在贴壁型明显低于腺泡型和实性型(P=0.014；P=0.009)，而腺泡型和实性型比较，差异无统计学意义，其他亚型之间比较也无统计学意义(图1，表2)。

表2 EZH2蛋白在肺腺癌不同亚型中的表达

2.3 EZH2蛋白表达与腺癌部分临床指标的关系 EZH2蛋白在肺腺癌中的表达与患者的性别、年龄无关，与肿瘤的大小及T分期有关，肿物越大，分期越高，EZH2阳性率越高(P<0.05)。但与有无淋巴结转移无关，尽管在淋巴结转移组的阳性率(92.86%)高于无淋巴结转移组的阳性率(80.56%，表3)。

2.4 EZH2蛋白的表达与EGFR基因突变的相关性分析 50例腺癌组织中26例发生EGFR基因突变，突变率为52.00%，其中EZH2阳性组中21例突变，突变率为50.00%，EZH2阴性组中5例突变，突变率为62.50%，EGFR基因突变率在EZH2阴性组略高于EZH2阳性组，但是二者相比差异无统计学意义，EZH2的表达与EGFR基因突变无相关性。

2.5 EZH2蛋白的表达与EGFR基因突变类型的分析 EGFR基因突变中外显子19突变率最高，其次是外显子21的突变，二者占所有突变的84.61%。EZH2的表达与EGFR基因突变类型无相关性(表4)。

表3 EZH2蛋白表达与腺癌部分临床指标的关系

表4 EZH2蛋白的表达与EGFR基因突变类型的分析

3 讨 论

EGFR-TKIs通过抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，进而阻断EGFR介导的下游信号传导，最终抑制肿瘤的增殖，浸润和转移[5]。该类药物特异性高，不良反应小，能显著延长患者的总生存期和无进展生存期[2]。然而这些药物仅适用于EGFR突变敏感的患者，而且常会在服药9个月后不可避免地出现继发性耐药，使肺癌患者的治疗陷入了新的困境，所以寻找新的靶向药物，降低患者EGFR-TKIs的耐药性已成为研究的热点。

果蝇Zest基因增强子人类同源物2(Enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)属于PcG(Polycomb Group)家族，是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶，可催化组蛋白H3第27位赖氨酸残基发生甲基化[3]，引起下游上百种基因表达的沉默[4],在多种肿瘤中过度表达，且与肿瘤的浸润转移及不良预后密切相关，因此EZH2被认为是一种癌基因。目前已有文献[6,7]报道EZH2在肺癌中高表达，而在正常肺组织及肺良性病变组织中低表达或无表达。本实验发现，EZH2在肺腺癌组织中的表达明显高于正常肺组织和肺良性病变组织，而在正常肺组织和肺良性病变组织间无明显差异。提示EZH2可能参与了肺腺癌的发生，可能是肺腺癌的驱动基因。Hu等[8]发现，肿瘤越大，EZH2的表达率越高。Wan等[9]发现，EZH2的表达在小细胞癌明显高于鳞癌和腺癌，且EZH2的表达与肺癌的TNM分期及淋巴结转移相关，分期越高，有淋巴结转移者EZH2表达率越高。说明EZH2参与肿瘤的发展和预后。本研究发现，肺腺癌中EZH2的表达与肿瘤的大小及T分期有关，但与淋巴结转移无关，虽然EZH2蛋白在淋巴结转移组中的表达率高于无淋巴结转移组，但差异无统计学意义，这可能与研究对象个体差异及样本量较少有关。另外，本实验首次对肺腺癌不同亚型间EZH2蛋白的表达进行研究，结果发现EZH2蛋白表达在贴壁型明显低于腺泡型和实性型，而腺泡型和实性型相比无统计学差异，其他亚型之间比较均无统计学差异。说明EZH2蛋白的表达在肺腺癌不同亚型之间存在一定差异。上述结果提示EZH2高表达与肺腺癌的恶性演变及侵袭生长有关。

有研究报道，EZH2表达在铂类化疗药的敏感组中明显低于耐药组[10]，在EGFR突变组明显低于未突变组[11]，当抑制EZH2的表达后，癌细胞的增殖和侵袭能力下降[12,13]，凋亡增强[14,15]，对顺铂的敏感性增强[10]，同时EGFR突变患者对拓扑异构酶Ⅱ(TOPII)抑制药的敏感性增强[16]。本实验结果显示，EZH2表达与EGFR基因突变状况无关，与EGFR基因突变类型亦无关。虽然EZH2表达在EGFR突变组低于未突变组，但差异无统计学意义，这可能与样本量少有关。

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(2017-02-20收稿 2017-03-22修回)

(责任编辑 尤伟杰)

Relationships between EZH2 expression and EGFR mutation in lung adenocarcinoma

WANG Yuxin1, ZHAO Tianmiao2，BAO Fang3，HAN Yanhua4，KONG Lili5，and SUN Mei5.
1.Department of Pathology, 2.Department of Facilities，3. Department of Military Healthcare，Jilin Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Changchun 130052,China;4. Training Base of Jilin Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Force, Changchun 130032,China;5.Department of Pathology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130042,China

Objective To explore the expression of EZH2 in lung adenocarcinoma and its associations with EGFR mutation.Methods Immunohistochemistry was used to examine the expression of EZH2 while EGFR mutation was detected with real-time fluorescence PCR.Results The expression of EZH2 in lung adenocarcinom(84.00%) was significantly higher than in normal lung tissues(12.00%) and in benign lung disease(11.11%) (P<0.05). EZH2 expression was related to tumor size, histological subtypes of adenocarcinoma and T stage(P<0.05), but not to EGFR mutation.Conclusion EZH2 may be involved in lung oncogenesis and development. The expression of EZH2 is not linked to EGFR mutation. It can be a new target for the treatment of lung adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma；EZH2；EGFR mutation

吉林省直卫生专项项目(编号：3D5153523429)

王玉欣，本科学历，主治医师。

130052 长春，武警吉林总队医院：1.病理科，2.器械科,3.军疗科； 4.130032 长春，武警吉林总队后勤训练保障基地卫生队；5.130042 长春,吉林大学二院病理科

孙 梅，E-mail:sun.mei55@yahoo.com

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