数控与传统发酵普洱茶抗氧化活性与化学成分的比较

王兴华，念波，段双梅，严亮，杨瑞娟，崔廷宏，蒋勋，郑文忠，赵明，罗朝光*

1(云南省普洱茶树良种场，云南 普洱，665000)2(云南农业大学 龙润普洱茶学院，云南 昆明，650201) 3(普洱茶研究院，云南 普洱，665000)

数控与传统发酵普洱茶抗氧化活性与化学成分的比较

王兴华1，念波2，段双梅2，严亮3，杨瑞娟3，崔廷宏1，蒋勋1，郑文忠1，赵明2，罗朝光1*

1(云南省普洱茶树良种场，云南 普洱，665000)2(云南农业大学 龙润普洱茶学院，云南 昆明，650201) 3(普洱茶研究院，云南 普洱，665000)

分别应用数控与传统方法进行普洱茶发酵，应用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定发酵样品的化学成分，结合电子鼻和感官审评比较发酵样品品质特征，并测定比较出堆样品的体外抗氧化活性。结果表明，2种发酵过程水浸出物、茶多酚、茶黄素、茶红素、儿茶素含量降低，茶褐素、咖啡碱含量增加，但数控发酵过程中，化学成分含量变化速度更快，且“堆味”更少。数控发酵出堆样的总抗氧化活性、超氧阴离子清除活性能力低于传统发酵，羟自由基清除活性高于传统发酵，而DPPH自由基清除活性二者之间没有显著性差异。总之，数控与传统发酵茶叶化学物质变化规律相同， 但发酵速度更快，香气更好。

普洱茶发酵；数字化；化学成分；抗氧化活性；电子鼻

普洱茶是以云南大叶种茶树[Camelliasinensis(Linn.) var.assamica(Masters) Kitamura]的晒青毛茶为原料，采用后发酵等工艺制成的具有独特品质特征的茶叶[1]。其汤色红浓明亮，香气陈香，滋味醇厚甘滑。研究发现普洱茶具有降脂减肥、抗氧化、抗菌、抗突变或肿瘤、保护神经损伤、抑制α-葡萄糖苷酶等保健功能或生物活性[2-3]。由于独特的口感和良好的保健功能，普洱茶在国内外具有较好的销量。

后发酵是普洱茶加工的关键工艺，一般是将晒青毛茶潮水、渥堆、翻堆(潮水)数次的过程。目前云南普洱茶的发酵一般沿用传统的人工操作，依靠环境微生物进行自然发酵。在传统的普洱茶生产过程中存在着品质不稳定、人工劳动强度大、生产效率低等诸多问题，严重影响普洱茶产业健康、持续、稳定发展[4]。开发新的发酵控制设备，成为普洱茶产业转型升级的必由之路。近年来已有部分学者在普洱茶发酵机械方面开展了一些研究，如孙杨锋等设计了滚筒式潮水机械[4]，吴晓强等开发出一套以S7-300 PLC为核心的发酵车间温湿度控制系统[5-6]，刘晗通过硬件(传感器、集成网控系统与PC)和软件(zigbee通信、WIFI通信和GPRS通信监测)的研究建立了数字化普洱茶发酵系统[7]，赵永洁等设计了普洱茶发酵车间测控系统[8]，马振纲等构建了普洱茶发酵清洁化车间[9]，吴绍帅等研发集自动潮水、保温保湿发酵、旋转翻堆等技术于一体的多功能双层保湿转动式普洱茶发酵罐[10]，马振纲等建立了由PLC主控设备、传感器(温湿度传感器)、变送器、计算机处理系统(人机界面显示)、智能化加温和加湿设备等构成的普洱茶发酵自动化设备[11]。这些发酵设备，尤其是基于PLC控制系统的发酵设备为普洱茶的现代化生产提供了技术支持。但以上发酵控制设备仍存在翻堆困难及发酵罐每批次发酵茶叶量较少的缺点，在实际应用方面存在一定的局限。

为了建立可实际使用的普洱茶发酵系统，本项目组前期在红茶发酵控制系统的基础上研究开发了数字控制立体普洱茶发酵系统(图1)。该系统主要包括由PLC、温湿度传感器以及温湿度控制系统组成的发酵室与立体普洱茶发酵筐组成。与已有报道相比，本系统最大的特点是采用立体发酵筐代替渥堆方式，更容易实现机械化翻堆。为此本研究应用该数控普洱茶发酵系统与传统方式分别发酵了一批次普洱茶，测定比较发酵样品的化学成分、抗氧化活性与感官品质，为该系统的推广应用提供实验依据。

图1 普洱茶数控发酵系统照片Fig.1 Photographs of numerical control Pu-erh tea fermentation system

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发酵原料

普洱茶树良种场2014年生产的三级晒青毛茶。

1.1.2 实验试剂

甲醇、FeSO4、酒石酸钾钠、Na2HPO4、KH2PO4、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇、超纯水、Na2CO3、草酸、AlCl3、磷酸盐、茚三酮、抗坏血酸、DPPH(1,1-二苯基-2-苦基苯肼)、焦性没食子酸为国产分析纯试剂，羟自由基测试试剂盒与总抗氧化能力测试试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，液相色谱所用的色谱纯乙腈为Sigma产品。咖啡碱(CA)、儿茶素(C)、没食子酸(GA)、1,4,6-tri-O-galloyl-_-D-glucose(G-G)、表没食子酸儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)对照品均购自天津一方科技有限公司。

1.1.3 实验仪器

电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司；HH-S28S数显恒温水浴锅，金坛市大地自动化仪器厂；101A-2型电热鼓风恒温干燥箱，上海市崇明实验仪器厂；电子鼻(PEN3)，北京盈盛恒泰科技有限责任公司；756CRT紫外可见分光光度计、茶样粉碎机、实验室蒸馏水机、玻璃干燥器、茶叶审评设备等；1200型高速液相色谱系统，美国安捷伦；包括VWD检测器、柱温箱、自动进样器、在线脱气机、溶剂输送泵。

1.2 方法

1.2.1 普洱茶发酵与样品采集

1.2.1.1 传统普洱熟茶发酵

晒青茶2 t，潮水800 kg，至含水量38%，堆成0.7 m高的茶堆，覆盖湿麻布发酵；发酵过程间隔6～8 d翻堆补水；发酵过程记录发酵堆4个层面的堆温以及发酵室的温湿度。翻堆前取发酵阶段样品，室温阴干进行后续分析，各样品见表1。

1.2.1.2 数控立体普洱茶发酵

晒青茶6 t，潮水2.4 t，至含水量38%。潮水混匀后，将茶叶盛满大号塑料框，每框30 kg左右，放置在多层发酵架上置于发酵室发酵。发酵室全封闭，应用PLC系统对温度、湿度、供氧、排碳进行调控，实现发酵过程茶叶温度、湿度、氧气的自动化监测与控制。发酵间隔6～12 d，混合补水，共进行3次混合。混合补水前取样后，经空气干燥进行后续分析，各样品见表1。

表1 传统与数控发酵样品

1.2.2 茶叶化学成分测定

1.2.2.1 水浸出物、茶多酚、茶多糖、茶色素的测定

按2015版国标测定茶样水浸出物[12]，应用酒石酸铁比色法、茚三酮比色法、硫酸蒽酮法和萃取比色法，测定茶叶茶多酚[13]、茶多糖[14]和茶色素[15](茶黄素、茶褐素和茶红素)的含量。

1.2.2.2 儿茶素类、咖啡碱的测定

应用实验室建立的高效液相色谱法测定茶叶儿茶素、没食子酸、咖啡碱的含量，主要方法如下：

(1)样品提取：称取1.0 g茶叶磨碎样品，加入2%磷酸10 mL，再加入10 mL甲醇，混合静置1 h，过滤于50 mL容量瓶，重复提取2次，定容至50 mL，测定前经0.2 μm过滤，待测。

(2)高效液相色谱：使用TSKgel ODS-80TM色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，日本TOSOH)分离；流动相A为0.261%磷酸，5%乙腈；流动相B为0.261%磷酸，80%乙腈；洗脱梯度程序为0～21 min B液从10%线性梯度增加至20%；21～22 min，B液从20%线性梯度增加至100%；22～26 min，B液100%保持不变；26～26.5 min，B液由100%线性梯度降低至10%B；27 min程序停止；以10%B液后运行平衡5 min；流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长280 nm；根据保留时间确定化合物，使用外标法根据峰面积定量。

1.2.3 茶叶香气分析

1.2.3.1 样品制备

每个茶样称取1 g干茶放进150 mL三角瓶中，加入50 mL沸水冲泡5 min，过滤，滤液静止45min冷却待测。每个茶样重复制备3个样品，重复3次测定。

1.2.3.2 测定与分析

采用德国Airsens公司PEN3便携式电子鼻(Portable Electronic Nose)进行检测，利用Airsense公司编制的电子鼻配套软件WinMaster实现电子鼻工作过程控制及数据分析。对两种方式发酵样品茶水的电子鼻响应值生成的初始特征向量进行主成分分析。仪器设定测定60 s，清洗通道120 s，平衡45 s，取响应信号区间48～52 s进行分析。

1.2.4 感官审评

根据国家标准[16]中各类茶叶品质特征的描述和要求对实物标准样进行审评。

1.2.5 体外抗氧化活性研究

采用紫外-可见分光光度法+抗氧剂提取液方法测定清除DPPH(二苯代苦味酰自由基)自由基能力[17]，采用邻苯三酚自氧化法测定清除超氧阴离子的能力[18]。使用南京建成生物工程研究所的抗氧化能力(T-AOC)和羟自由基能力测试试剂盒测定总抗氧化能力(T-AOC)和抑制羟自由基能力。综合以上实验结果评价比较样品的体外抗氧化活性。

1.2.6 数据分析

每次翻堆收集2份样品，每份重复提取2次，每个提取液重复测定2次，以 mean±SD表示平均值。利用单因素方差分析处理实验数据，组间采用最小显著差数法进行两两比较，P<0.05 为差异显著。本论文中的统计分析和数据处理应用软件IBM spss statistics 22(SPSSInc., Chicago, IL)进行。

2 结果与讨论

2.1 普洱茶发酵

分别采用传统方法与数控发酵系统发酵普洱茶，记录发酵茶叶温度与发酵室温度，见图1。由图可知，传统发酵中，发酵室温度不可控制，其温度主要与当地气候相关。另外，传统发酵如果发酵堆太小，可能导致茶堆温度不能上升，存在所谓“冷发酵”问题，降低发酵品质。而数控系统可以通过监测与加温控制发酵室温度，即使小框发酵(每框30 kg)，茶叶温度也可以快速上升，并在24 h内达到40 ℃，达到传统普洱茶发酵的茶叶温度。发酵过程中的茶叶取样监控发现，数控发酵茶叶(色泽、滋味)变化更快，33 d左右已达到传统发酵的出堆标准，即停止发酵。为了比较本研究中的2种发酵方式，传统发酵也随即停止。2种发酵均进行了3次翻堆，加上原料与出堆样品，各5份发酵样品。

图2 传统与数控发酵茶叶与发酵室温度Fig.2 The temperature of tea mass and fermentation room in traditional and numerical control fermentation

2.2 普洱茶发酵过程化学成分变化

测定原料与发酵样品的水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、多糖、茶色素、儿茶素、咖啡碱、没食子酸等化学成分(表2和图3)，部分测定液相色谱图见图3。

图3(a)发酵过程水浸出物、茶多酚、多糖和咖啡碱的变化；(b)发酵过程儿茶素的变化Fig.3 (a) the changes of water extraction, tea polyphenols, caffeine and soluble sugar during Pu-erh tea fermentation；(b) the changes of catechins during Pu-erh tea fermentation

化学成分原料传统一翻传统二翻传统三翻传统出堆数控一翻数控二翻数控三翻数控出堆水浸出物/%45.68±0.80bc45.02±1.45b47.92±1.98ab48.19±1.13a43.18±1.33d45.52±1.41ab41.62±0.74cd42.90±0.38c39.78±1.02de茶多酚/%33.66±1.41a32.01±0.97ab31.67±1.08b25.62±1.56c18.59±0.32e25.07±1.95b18.12±1.92c16.50±1.10cd14.22±1.46d可溶性糖/%3.83±0.18e4.90±0.22b3.76±0.31ef4.37±0.38cd4.42±0.20c4.01±0.14b4.51±0.27a3.81±0.27bc3.61±0.05cd咖啡碱/%2.96±0.03ef3.09±0.02cd3.13±0.02cd3.24±0.02ab3.31±0.02a3.20±0.02cd3.39±0.01c3.63±0.02ab3.64±0.03a茶黄素/%0.18±0.01f0.37±0.09a0.30±0.05bc0.33±0.02ab0.26±0.02de0.23±0.01a0.19±0.02cd0.20±0.01b0.19±0.01bc茶红素/%7.07±0.16ab7.44±0.30a6.49±0.15c6.00±0.21d4.92±0.26f6.33±0.26b3.31±0.35c2.99±0.15cd2.88±0.61de茶褐素/%2.89±0.12f3.64±0.16de3.96±0.70d5.38±0.21c9.32±0.37a3.96±0.13d5.60±0.30c10.13±0.20b11.96±0.37aC/(mg·g-1)5.29±0.51a4.86±0.39bc4.96±0.36b4.39±0.88cd3.17±1.46ef4.89±0.31bc3.77±0.91b4.70±0.36cd4.07±0.56dEC/(mg·g-1)12.33±1.20cd21.21±1.61a19.28±1.31b12.53±2.07c1.36±0.36e18.07±1.03c11.32±1.41d12.09±0.81bc8.80±0.76eEGC/(mg·g-1)38.59±3.46c55.57±4.33a44.54±3.04b30.73±4.43d22.55±2.95e49.00±2.84a28.49±3.24c26.24±2.01cd18.45±4.49eECG/(mg·g-1)38.60±5.33a10.14±0.96b4.45±0.75c2.66±0.80cd2.00±0.85ef15.16±2.55b8.45±2.20c3.58±0.54d2.04±0.76deEGCG/(mg·g-1)98.10±6.90a22.86±1.63b9.38±1.69c3.32±0.80ef7.25±0.48cd34.15±1.57b17.45±1.44c6.50±0.25d3.11±0.22ef儿茶素总量190.42±12.44a114.63±8.37b82.61±5.64c53.63±8.91d36.33±2.34ef121.27±10.77b69.47±11.80c53.11±4.15d36.60±7.22e

由表2和图3a、图3b可知，原料经2种方式发酵后，化学物质变化规律基本相同，茶多酚、儿茶素组成及总量降低；咖啡碱含量增加，由原料的2.96%分别增加至传统的3.31%和数控的3.64%；茶红素含量降低，而茶褐素增加。2种方式普洱茶发酵的主要化学成分变化符合罗龙新[19]等人的研究。

数控发酵与传统发酵在发酵过程中，成分含量变化基本一致，数控发酵变化趋势较大，可缩短发酵时间，提高效率。通过PLC系统控制发酵条件达到化学成分因子可控化，提高普洱茶品质。通过对设备的不断完善，可精确、快速地控制发酵条件，从而更好地提高普洱茶品质。

图4 茶样儿茶素、咖啡碱测定的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatog rams for determination of catechins and caffeine in tea samples

2.5 香气分析

应用电子鼻以及PCA对茶汤测定分析发现，发酵样品与原料香气显著不同，在PCA上聚成不同的簇。数控与传统发酵各阶段样品在PCA上也呈现不同的聚簇，表明其香气组成不同。感官审评发现，传统发酵的“堆味”更明显，而数控发酵样品“堆味”不显著，推测这可能是PCA上聚簇分开的主要因素。数控发酵“堆味”不显的原因可能是因为采用小框发酵堆味产生少、散发快，另外发酵室通风通气也可能是“堆味”弱的重要原因。传统茶叶发酵的堆味可能需要1～3年的贮存才能散发，而数控发酵的堆味弱，则可缩短储存周期，提高产品生产效率与资金周转率。

图5 数控与传统发酵阶段样品茶汤香气的PCA分析Fig.5 PCA analysis of aroma of tea brew of fermented tea leaves collected in traditional and numerical control fermentation

2.6 感官审评

为了进一步评价2种发酵模式样品的品质，采用国家标准法对茶叶样品进行了感官审评，结果见表3、图6。随着发酵进行，传统发酵样品干茶色泽由原料的墨绿变为红褐，叶底由黄绿变为红褐柔软，汤色由黄绿变为红亮较浓，滋味由浓醇回甘变为醇和稍涩，发酵一翻、二翻样品茶汤显酸味，香气由清香变为堆味明显、略带陈香。数控发酵样品干茶色泽由原料的墨绿变为红褐，叶底由黄绿变为红褐柔软，汤色由黄绿变为褐红明亮，滋味由浓醇回甘变为醇厚，香气由清香变为陈香显。比较2种发酵方式可以发现，数控发酵样品变化更快，这与化学成分测定结果相符。

表3 传统与数控发酵样品审评结果

2.5 体外抗氧化能力测定

为了进一步比较2种发酵方式，课题组测定了出堆样品的体外抗氧化活性(表5)。由表可知，2种发酵出堆样品均具有抗氧化活性，比较可知传统发酵样品的总抗氧化活性、超氧阴离子清除活性高于数控发酵样品(P<0.05)，而羟自由基清除活性低于数控发酵样品(P<0.05)，传统发酵样品与数控发酵样品之间的DPPH自由基清除活性没有显著性差异(P>0.05)。不同自由基清除能力不同，可能与茶叶样品化学成分不同有关。

表5 传统发酵数控发酵出堆样的抗氧化活性比较

注： “对应Vc浓度”是指按GB/T 8312—2002 中11.1 的规定制备茶汤试液。3 g茶的浸提换算为1 g茶167 mL浸提后的抗氧化活性在Vc标准曲线中对应的浓度。其中DPPH自由基清除活性，羟自由基活性茶汤稀释10倍，即1 g茶溶于1 670 mL水的浸提。*表示2种发酵模式出堆样品活性有显著差异(P<0.05)

3 结论

测定发现该数控普洱茶控制系统发酵茶叶的化学成分变化规律与传统类似，且变化速度更快。感官审评与香气分析认为数控发酵样品“堆味”更弱，可缩短后期的陈化时间。传统与数控发酵出堆样品都具有一定的抗氧化活性。通过对发酵室温度、湿度的控制，数控发酵系统可稳定普洱茶品质；由于采用小型发酵框，可实现机械翻堆，为云南普洱茶的清洁化及自动化生产提供了设备基础。

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Comparison on chemical compounds and antioxidant activity of Pu-erh Tea fermented by numerical control and traditional methods

WANG Xing-hua1， NIAN Bo2， DUAN Shuang-mei2， YAN Liang3， YANG Rui-juan3，CUI Ting-hong1， JIANG Xun1， ZHENG Wen-zhong1， ZHAO Ming2， LUO Chao-guang1*

1( Pu-er Tea Varity Multiplication Farm of Yunnan, Puer 665000,China)2(College of Long Run Pu-erhTea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201,China)3(Pu′er Institute of Pu-er Tea，Puer 665000,China)

Two fermentations of Pu-erh tea were developed by numerical control and traditional methods, respectively. The chemical compounds of tea leaves were detected by high-performance liquid chromatography (HPLC) and spectrophotometric methods. The quality was compared by electronic nose test and sensory evaluation. Theinvitroantioxidant activity of final fermented tea leaves was also determined and compared. The results showed that the contents of water extraction, tea polyphenols, theabrownin (TB), theaflavin (TF), and catechins were decreased; the contents of thearubigin (TR), caffeine and soluble sugar were increased. However the speed of chemical change in numerical control fermentation was faster than that in traditional fermentation; and the “pile aroma” was lower than that in traditional fermentation. The total antioxidant and superoxide anion radical scavenging activity of final fermented tea leaves in numerical control fermentation were lower than that in traditional fermentation; and hydrogen donating scavenging capacity of final fermented tea leaves in numerical control fermentation was higher than that in traditional fermentation. The DPPH scavenging capacity had no significant difference. In brief, the chemical change rule in numerical control and traditional fermentation was same; and compared to traditional fermentation, the fermentation speed was faster and the flavor was better in numerical control fermentation.

Pu-erh tea fermentation; numerical control; chemical compounds; antioxidant activity; electronic nose

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705022

农艺师(罗朝光高级农艺师为通讯作者，E-mail：wangxh9733@163.com)。

2016年农业生产发展专项资金-茶叶数字化加工技术研究与推广项目

2016-12-06，改回日期：2016-12-26