浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析

施思，彭智辅，乔宗伟,2，刘多涛，罗青春，涂福明

1(五粮液股份有限公司，四川 宜宾，644007)2(固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾，644007)

浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析

施思1*，彭智辅1，乔宗伟1,2，刘多涛1，罗青春1，涂福明1

1(五粮液股份有限公司，四川 宜宾，644007)2(固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾，644007)

为了探究大曲贮藏过程中微生物群落结构变化，采用高通量测序技术分析了真菌18S rDNA V4区，聚类分析共产生3 747个OTU分类。结果表明，在贮藏过程中大曲真菌群落结构不断调整，毕赤酵母属、根霉菌属及横梗霉属成为最终的优势菌群。随着时间的推移，大曲发酵力逐渐升高，而糖化力则经历了由高变低再升高的过程。数据结果与大曲质量要求相符，能为后续酿造提供足够动力。

大曲；储藏；真菌多样性；理化指标

在我国传统酿酒行业一直流传着“曲乃酒之骨”的说法，曲药既是酿酒的糖化发酵剂，又是酿酒的重要原料，同时为酿酒提供部分风味物质或风味前体物质，对白酒的香型风格有着举足轻重的作用。五粮液作为中国浓香型白酒的典型代表，采用了独特的“包包曲”制曲工艺，以小麦为原料，经粉碎、加水拌合压制而成，天然接种，多微共酵。

作为中国传统酿造的浓香型白酒大曲，其微生物菌群的丰富度不言而喻，微生物的生长代谢也决定着大曲品质的优良。近年来，随着测序技术的迅猛发展，广大科研工作者为了更加全面的认识曲药微生物，采用免培养技术做了大量研究。梁晨等人采用Mi Seq测序方法研究了大曲贮存过程中原核微生物群落结构演替规律，共得到3 710个OTUs，指出乳杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、高温放线菌属、乳球菌属等是大曲中的优势菌群[1]；高亦豹等人利用PCR-DGGE技术对江苏北部某酒厂高温和中温大曲细菌菌群结构进行了分析，检测到了传统方法未能分离鉴定的Staphylococcusxylosus、Klebsiellaoxytoca[2]。另外，孟镇等人运用DGGE技术及条带测序解析了山东某酒厂浓香型白酒大曲的细菌菌群，其结果显示了该酒厂大曲中细菌主要属于厚壁菌门[3]；罗惠波等人利用PCR-SSCP技术对泸州老窖大曲发酵过程中原核微生物菌群结构进行了研究，结果发现大曲发酵温度的变化对原核微生物多样性影响较小，而发酵后期的湿度、水分可能是造成原核微生物多样性改变的重要原因[4]。大量研究结果表明，免培养方法检测大曲微生物组成更为直观、高效和全面。

综合浓香型大曲微生物研究现状和研究手段可知，利用高通量测序技术对真菌微生物的研究相对较少，而大曲作为糖化发酵剂，糖化力和发酵力是衡量大曲质量的重要指标，与之相关的微生物更是研究热点。而大曲在投入生产前会经过长达数月的储存过程，期间发生多种生化反应，使得微生物区系结构、酶系结构、物系结构都会发生重大变化，是重要的后熟过程，对最终曲药质量产生重要影响，也很有必要对其进行深入研究。因此本研究选取储藏期大曲样本进行针对18S rDNA V4区高通量测序，并跟踪检测其糖化力发酵力变化规律，一方面可以了解大曲微生物菌群的基本构成和丰度变化，弄清微生物多样性的构成差异与不同大曲质量的相关关系，另一方面，研究结果可以为更好地理解大曲贮藏的科学必要性提供一些参考数据及新的思路。

1 材料与方法

1.1 曲样

选取五粮液制曲车间某一陈化曲库，在其储存过程中进行定点跟踪取样，每月1次，共计5个样品。样品破碎成粉后用无菌袋密封，按取样时间依次标记为1、2、3、4、5。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂

真菌宏基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)；Q10212 Qubit2.0 DNA检测试剂盒(life)；

V43NDF引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGA￣T￣C￣T￣N￣G￣G￣C￣A￣A￣G￣T￣C￣T￣G￣G￣TGCCAG；

EukV4R引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACC￣C￣G￣A￣G￣A￣A￣TTCCAACGGTATCTRATCRTCTTCG。(上海生工)；理化检测试剂均为国产分析纯。

1.2.2 仪器

UNIVERSAL 320R冷冻离心机；HWS26型电热恒温数字水浴锅；T100TMThermal Cyeler PCR仪；DYCZ-21电泳槽；美国UVP凝胶成像系统等。

4S=(b+e+h)+(d+e+f)+(a+e+i)+(c+e+g)=(a+b+c)+(d+e+f)+(g+h+i)+3e=3S+3e，所以有S=3e.由此可以得到：

1.3 实验方法

1.3.1 宏基因组提取

采用差速离心法收集微生物细胞沉淀[1]，采取反复冻融与试剂盒相结合的方法，收集DNA，置于-20 ℃保存；利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应加入的DNA量。按照产品说明书进行操作。

1.3.2 PCR扩增

利用引物V43NDF和EukV4R对大曲真菌基因组18S rDNA V4进行扩增。扩增体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L each) 0.5μL，DNA10 ng，引物F(50 μmol/L) 0.5 μL，引物R (50 μmol/L)0.5 μL，PlantiumTaq(5 U/μL)0.5 μL。扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，共5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共20个循环；72 ℃ 5 min。

1.3.3 DNA纯化及高通量测序

1.3.4 糖化力及发酵力测定

按照五粮液企业技术标准执行(2005年颁布)。糖化力：1 g绝干曲，在30 ℃、pH4.6、60 min分解可溶性淀粉为葡萄糖的质量(mg)，即mg/(g·h)，底物为2.0%的可溶性淀粉溶液；发酵力：1 g绝干曲在30 ℃发酵72 h利用蔗糖产生CO2的体积(mL)，即mL/(g·72 h)，底物为8%的蔗糖溶液。

2 结果与分析

2.1 真菌多样性分析

2.1.1 测序序列数目和多样性指数分析

由图1及表1的Coverage指数可知，取样覆盖率均超过97%以上，样品随着测序序列数的增加，多样性指数曲线趋于平坦，说明本次试验取样合理，结果能代表样本的真实情况，更多的取样仅会产生少量的OTU。

对各样本测序序列进行质控过滤后，大曲储藏过程中的5个样本测序共获得116 122条序列，聚类分析共产生3 747个OTU分类。Shannon 指数、Chao1指数是常用的描述群落物种多样性的指数，其中，Shannon值越大，说明群落多样性越高；Chao1指数常用来估计物种总数，其值越高，物种丰富度越高[5]。由表1可知，大曲真菌微生物多样性随着储存时间的推移，Shannon index有所上升，接下来则需弄清微生物组成具体发生了哪些变化。

表1 操作单元分类和多样性指数分析

图1 样品稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve of samples

2.1.2 OTU分布的Venn图

Venn图可以用来统计样本中共有和独有的OTU的数目，直观地展现样品OTU数目组成的相似性及重叠情况。如图2所示，样品1到5独有的OTU数目依次为654、667、737、680和590，均远远超过自身总OTU的半数以上；5个样品共有的OTU仅28个，其所代表的真菌物种长期存在于储藏期内。通过Venn图可以看出，每个样品都具有极高的特异性，说明真菌结构随着时间的变迁发生了较大的改变。接下来，我们将通过真菌多样性分析，弄清哪些物种的改变和数量的变化造成了这样的差异。

图2 不同样品的OTU韦恩图Fig.2 Venn profile of OTU in different samples

2.1.3 大曲贮藏过程中不同时期真菌多样性分析

对样品中物种多样性进行分类分析，可以得到以下2个信息：(1)样品中含有何种微生物；(2)各微生物的相对丰度。为了展示效果，一般只显示相对丰度前50的物种分类，剩余物种合并为other。

如图3所示，在属水平上大曲贮藏过程中真菌多样性有较为明显的差异。大曲贮藏初始阶段，毕赤酵母属(Pichia)所占比例最高为42.27%，是样品1中第一大优势属，其次枝氯霉属(Ramichloridium)也是主要真菌类群，所占比例为26.09%。复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、根霉菌属(Rhizopus)和横梗霉属(Lichtheinia)也被检测到，所占比例分别为6.03%、5.24%和3.34%。此外，一类分类信息不明的真菌类群(unclassified)所占比例达到了12.4%。随着时间的推移，Ramichloridium不再是优势真菌，而Pichia比例也略有下降，在贮藏末期(样品5)中占比为28.11%，不过仍为相对数量最多的优势真菌；Rhizopus数量则稳步增加，最后比例达到了17.37%。最终，贮藏最后阶段的优势真菌类群为Pichia、Lichtheinia及Rhizopus。根霉菌(Rhizopus)是酿酒发酵中非常重要的常见菌，以产淀粉酶最为突出[6]，在一定条件下，根霉能进行边糖化边发酵，产生如乙醛、乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙醇等风味物质[7]；横梗霉属(Lichtheinia)是非常重要的产酯酶菌，吕梅从泸州老窖、枝江大曲等中温、高温大曲中筛选到了具有产酯酶活性的横梗霉菌[8]。此外我们也可以看到，Saccharomycopsis、Trichocoma等菌群虽然相对数量一直不够丰富，但在整个贮藏过程中稳定存在，也是比较重要的功能性微生物。

图3 各样本在属水平上的真菌群落结构柱状图Fig.3 The histogram of fungal community structure of all samples in the genus level

2.2 糖化力及发酵力分析

如表2所示，从糖化力指标上来看，大曲贮藏初期其值最高，中期逐渐降低，而末期又有所回升；从发酵力指标上来看，总体趋势为缓慢升高。最终，出库曲的糖化力为416 mg/(g·h)，发酵力为190 mL/(g·72h)，与生产上的要求一致，达到了出库标准，能为后续的酿造提供足够的动力和条件。

表2 各样品糖化力与发酵力结果

注：大曲品温数据由车间跟踪记录所得。

3 结论

本研究采用高通量测序技术对大曲真菌多样性进行分析，进一步揭示了大曲贮存过程中真菌微生物的多样性及群落结构变化。同时，在各样本的分析数据中还有一定比例的OTU没有属的归属，这当中可能存在新的物种，属于五粮液酿造微生物新资源。

结合糖化力发酵力指标可以看出，本次样品的最终群落特征与工艺需求相符。随着大曲贮藏时间的推移，大曲中真菌微生物的多样性指数总体趋势是逐渐升高的。其过程大致可分为3个阶段：(1)入库初始阶段，曲块品温较高，水分最大(样品1)，大曲发酵力最低，糖化力最高，初步推断该阶段糖化力发酵力指标受前期培曲工艺影响较大，酵母菌群虽占主体，但受温度影响，其活性可能受到抑制；(2)随着贮藏时间的推移，品温维持在30℃左右，水分下降约1%(样品2、3，4)。而从第1阶段过渡至第2阶段时，大曲温度及水分下降较快，真菌群落结构迅速调整，从Shannon指数可以看出，真菌微生物多样性提高明显，从2.08上升为2.57，期间指数略有下滑但总体平稳，其中根霉菌得到有效繁殖；(3)贮存末期(样品5)，曲块温度下降至22℃，Shannon指数达到最大值，从群落结构柱状图可以看出，该阶段真菌类群最为丰富，其中毕赤酵母菌，根霉菌趋于稳定，横梗霉菌也成为了优势真菌，该群落结构也为大曲相应指标的提升奠定了基础。一般认为，糖化力主要与根霉菌有关，发酵力主要与酵母菌有关。从试验结果可以发现，相关菌群相对数量的多少并不能完全决定糖化力与发酵力的大小，这说明大曲微生物的活动是复杂的，微生物在一定条件下可以进行繁殖，但受到不同温湿度影响，其代谢产酶等活动会表现不一。因此，我们可以通过特定的培养方法，分离筛选优势酵母菌，根霉菌，分析其功能性，为工艺控制及解释传统大曲的发酵代谢机理提供更完善的科学依据。

[1] 梁晨,杜海,徐岩.大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分演替规律研究.微生物学通报2017,44(2):384-393.

[2] 高亦豹,王海燕,徐岩.利用PCR-DGGE未培养技术对中国白酒高温和中温大曲细菌群落结构的分析[J].微生物学通报,2010, 37(7):999-1 004.

[3] 孟镇,熊正河,钟其顶,等.应用PCR-DGGE技术解析白酒大曲细菌群落结构[J].食品与发酵工业,2010,36(10):159-163.

[4] 罗惠波,黄治国,李浩,等.浓香型大曲原核微生物群落的PCR-SSCP 解析[J].微生物学通报,2009,36(9):1 363-1 367.

[5] CHAO A,BUNGE J.Estimating the number of species in a stochastic abundance model[J].Biometrics,2002,58(3),531-539.

[6] 龙可,赵中开,马莹莹,等.酿酒根霉菌研究进展[J].现代食品科技,2013, 29(2):443-447.

[7] 冯春,汪光明,杨强,等.绿衣观音土曲中微生物种群区系分析及其功能研究[J].酿酒科技,2005,(3):39-42.

[8] 吕梅.Lichtheinia属HSM菌株酯酶发酵条件及酶学特性研究[M].武汉：湖北工业大学,2014.

Analysis of the change of saccharifying power and fermenting power for Luzhou-flavorDaquand their fungal diversity during storage

SHI Si1*, PENG Zhi-fu1, QIAO Zong-wei1,2, LIU Duo-tao1,LUO Qing-chun1, TU Fu-ming1

1(Wuliangye Group Co.,Ltd.,Yibin 644007,China)2(Solid-state Fermentation Resource Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Yibin 644007, China)

To explore the change of microorganisms communities ofDaquin the storage process, the V4 regions of fungal 18S rDNA were analyzed by high-throughput sequencing, 3747 OTUs were obtained in clustering analysis. The results showed that fungal community structure was constantly adjusted,Pichia,Rhizopus,Lichtheiniabecame the dominant genera at the end of storage. The fermenting power ofDaqugradually increased as time going on, while saccharifying power gradually decreased and then increased again. The data meet the requirements for quality ofDaqu, which can provide enough power for the subsequent brewing.

Daqu; storage; fungal diversity; physicochemical index

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705013

硕士研究生(本文通讯作者，E-mail: sstype@sina.com)。

固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金项目(2015GTJ004)

2016-12-21，改回日期：2017-02-08