地衣芽胞杆菌α-淀粉酶酸性pH稳定性提升突变体的生化特征

罗丹，靳晓，牛丹丹*，谢银珠，林娟，叶秀云

1(福州大学 生物科学与工程学院，福建省海洋酶工程重点实验室，福建 福州, 350116)2(福建福大百特科技发展有限公司，酶高效表达国家工程实验室，福建 福州, 350002)

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶酸性pH稳定性提升突变体的生化特征

罗丹1，靳晓1，牛丹丹1*，谢银珠2，林娟1，叶秀云1

1(福州大学 生物科学与工程学院，福建省海洋酶工程重点实验室，福建 福州, 350116)2(福建福大百特科技发展有限公司，酶高效表达国家工程实验室，福建 福州, 350002)

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacilluslicheniformisα-amylase, BLA) 的pH稳定性在提升发酵生产过程特别是后提取工段的操作稳定性，提高产品得率，弱化酶成品贮存条件和延长货架期等方面具有重要价值。该研究对1株能够合成更好pH稳定性BLA的地衣芽胞杆菌B186 1-1的BLA进行了分子克隆、序列分析及性质研究，与模式菌株ATCC14580来源的BLA氨基酸序列相比发现，有4个位点的差异，包括：N4K、R134L、E243D和S320A。进一步克隆表达与纯化了该菌株的BLA，重组酶在80 ℃、pH 6.0～7.5下显示最高活性；在pH 5.0下放置1 h，该酶保留80%以上酶活力，而来源于菌株ATCC14580的BLA在此相同条件下仅保留约10%酶活力；通过3D结构模拟分析显示BLA中的差异性碱基与其pH稳定性存在相关关系。

高温α-淀粉酶；天然突变体；pH稳定性；酶学性质

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacilluslicheniformisα-amylase，BLA，EC 3.2.1.1)，又称高温α-淀粉酶，是工业上极其重要的高温淀粉液化酶，可以以随机作用方式水解淀粉分子内的α-1,4-糖苷键，将其水解为糊精和一系列以葡萄糖为组成单位的低聚糖[1-2]，被广泛应用于食品、制药、纺织、造纸、洗涤液、饲料及石油开采等多种领域，占全球淀粉加工酶制剂总用量的30%[3-4]。

长期以来，针对BLA的研究主要包括：高表达、分子克隆与序列特征、定点突变与分子进化获得性能改进的新分子等等[5-9]。如，通过建立与优化表达系统，可实现BLA的超高水平的表达[10]；通过随机突变筛选与体外人工进化，显著改善BLA在酸性条件下的催化活力[11]。另一方面，在BLA工业生产过程中，BLA的pH稳定性对生产过程高效实施与控制也是十分重要的。BLA的pH稳定性尤其是在较低pH下的稳定性，可显著提升发酵生产过程特别是后提取工段的操作稳定性，提高产品得率，弱化酶成品贮存条件和延长货架期。因此，找寻BLA的pH稳定性突变体成为必然的研究内容[12-14]。

本文在前期工作的基础上，对1株产BLA的pH稳定性能提高的地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶进行进一步的分析鉴定，采用分子克隆技术克隆与序列分析了其编码基因并就其重组酶的相关性能进行了分析。研究结果可为BLA工业属性的人工进化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis) B186 1-1为从自然样本中分离保藏的野生菌株；地衣芽胞杆菌模式菌株ATCC14580、用于质粒构建宿主的大肠杆菌(Escherichiacoli) JM109、用作表达宿主的E.coliBL21(DE3)、用作表达载体的质粒pET28a(+)，皆由福建省海洋酶工程重点实验室保藏。

1.2 试剂

限制性内切酶BamH I、EcoR I及T4DNA连接酶等购自Thermo公司；质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒等分别购于Axygen；LATaqDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；硫酸卡那霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 培养基及配制方法

大肠杆菌常规培养用LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸提物5、NaCl 5，加入2%琼脂为固体培养基。必要时，在培养基中添加20g/mL硫酸卡那霉素。

1.4 分子克隆与基因扩增通用方法

染色体DNA的提取、质粒DNA的提取、酶切以及连接等按照常规实验方法进行[15]，使用试剂盒时按照试剂盒说明书进行；大肠杆菌转化采用化学转化法[16]。

PCR基因扩增按如下方法进行：设计BLA引物并化学合成，引物序列分别是：BLA-F：5'-TCGGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCTGATG-3'(下划线部分为人工设计BamHI位点)、BLA-R：5'-GGGGAATTCCATTTCATCCCCGCCTTACCTAT-3'(下划线部分为人工设计EcoRI位点)；PCR基因扩增条件是：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15s，62 ℃ 30s，72 ℃ 90s，30个循环；72 ℃ 10 min。

1.5 表达质粒的构建与鉴定

按照文献[15]进行。将上述PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化，再用BamHI和EcoRI双酶切并纯化，将此酶切后PCR产物克隆入pET28a(+)BamHI和EcoRI位点，重组质粒pET28a(+)-amyLB186和pET28a(+)-amyL14580在E.coliJM109中鉴定与保藏。

1.6 重组菌的构建与酶液制备

将上述构建好的重组表达质粒pET28a(+)-amyLB186和pET28a(+)-amyL14580转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含卡那霉素的LB平板上筛选阳性转化子[17]。转化子进一步经质粒提取和限制性酶切图谱分析。将正确的转化子接种于在250 mL三角瓶中用LB 培养基在37 ℃，200 r/min下培养12～14 h；10% (v/v)的接种量将上述转化子的培养物转接到发酵培养基中，在37 ℃，200 r/min下振荡培养至菌浓(OD600) 达到0.8左右，添加终浓度为1 mmol/L的IPTG，于30 ℃ 继续培养8 h；离心收集菌体，以磷酸盐缓冲液(pH 7.0) 洗涤悬浮，超声波细胞破碎仪破碎菌体(600 W，破碎8 s，间隔10 s，共20 min)。离心收集上清即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.7 重组酶的酶活测定

α-淀粉酶的活力检测采用二硝基水杨酸(DNS)法[18]。0.9 mL 1.0%可溶性淀粉底物，70 ℃ 预热5～8 min，加入用PBS缓冲液(pH 6.0)稀释后的酶液0.1 mL，立即计时，准确反应30 min，迅速吸取反应液0.5 mL加入到装有1.5 mL DNS的比色管中，准确煮沸15 min，立即冷却至室温并加入10.5 mL去离子水后于OD550测定吸光度。

酶活力单位定义为：1 mL稀释酶液在pH 6.0、70 ℃条件下，1 h水解1.0%可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖定义为1个酶活力，用U/mL表示。

1.8 重组酶的酶学性质研究

1.8.1 酶的最适反应温度

用pH 6.0的PBS缓冲液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用pH 6.0的PBS缓冲液稀释酶液，用1.7的酶活测定方法在30～100 ℃温度下进行淀粉酶的酶活测定。以最高酶活力为100%，计算其他温度下的相对酶活力，以确定其最适反应温度。

1.8.2 酶的热稳定性

用最适pH的PBS缓冲液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用最适pH的PBS缓冲液稀释酶液，将稀释好的酶液分别在60、65、70、75、80 ℃下保温1 h，每隔10 min取样，冰浴30 min后，用1.7的方法在最适温度下测定处理后各酶液的相对酶活力，以未进行热处理的酶液酶活力为100%，计算相对酶活，以确定酶的热稳定性。

1.8.3 酶的最适pH

用pH 3.0～9.0的PBS缓冲液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用相应pH的PBS缓冲液稀释酶液，以保证酶液处于不同的pH环境中，用1.7的方法在最适温度下测定酶液在不同pH环境中的相对酶活力，以最高酶活力为100%，计算其他作用pH值下的相对酶活力，以确定其最适作用pH。

1.8.4 酶的pH稳定性

用最适pH的PBS缓冲液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用pH 3.0～9.0的PBS缓冲液稀释酶液，把稀释好的酶液放在37 ℃条件下处理1 h，用1.7的方法在最适温度下测定处理后各酶液的相对酶活力，以未进行处理的酶液酶活力为100%，计算相对酶活，以确定酶的pH稳定性。

1.9 序列分析与三级结构模拟分析

PCR产物的核苷酸序列测定，采用双脱氧核苷链终止法进行[19]。核苷酸序列相似性分析利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行，氨基酸序列比对分析使用Clustal X2进行。BLA的三维结构模拟，利用在线软件Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org)，以PDB数据库中的1vjs.1.A(序列相似度99.38%)为模板进行同源建模分析[20]。

2 结果与讨论

2.1 高温α-淀粉酶的基因克隆

菌株B186 1-1为前期分离鉴定的1株地衣芽胞杆菌，合成与分泌pH稳定性能显著提高的BLA(未发表数据)。以此染色体DNA为模板，BLA-F、BLA-R为引物，进行PCR扩增，扩增出1.45 kb的基因片段。将此基因片段经酶切并克隆入pET28a(+)，获得重组表达质粒pET28a(+)-amyLB186。相似地，以模式菌株14580的染色体DNA为模板，扩增获得相应BLA编码基因，克隆获得重组质粒pET28a(+)-amyL14580。

2.2 高温α-淀粉酶的重组表达与重组酶的制备

将构建获得的重组质粒pET28a(+)-amyLB186和pET28a(+)-amyL14580转入大肠杆菌DE3中，分别获得重组菌DE3(pET28a(+)-amyLB186)和DE3(pET28a(+)-amyL14580)。重组菌DE3(pET28a(+)-amyLB186)在培养与诱导条件下能够很好地表达，SDS-PAGE显示，在55 kDa处第2～3泳道均出现了明显条带，与第1泳道中条带对比有明显差异，且大小与BLA理论值相符[7]，证明目的蛋白成功表达(图1)。进一步经过收集细胞、破碎菌体、亲和柱纯化等步骤制备与纯化重组酶，获得了电泳纯的重组酶(图1)。同样的方式制备并纯化模式菌株14580来源的α-淀粉酶。

M-蛋白质分子标准样品；1-菌株DE3(pET28a)菌体(对照)；2-菌株DE3(pET28a(+)-amyLB186))诱导培养后菌体破碎后离心上清；3-亲和纯化后的B186 1-1α-淀粉酶图1 重组大肠杆菌表达α-淀粉酶的SDS-PAGE分析Fig.1 The profile of SDS-PAGE of the recombinant E.coli expressed α-amylase

2.3 B186 1-1 α-淀粉酶在酸性pH条件下的稳定性显著提高

B186 1-1 α-淀粉酶及14580 α-淀粉酶分别用pH 3.0～9.0的PBS缓冲液在37 ℃条件下保温处理1 h，采用1.7描述的方法以未进行保温处理的酶活力为100%，在pH 7.0，80 ℃下测定酶活力，计算残余酶活力，确定酶的pH稳定性，得到B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶的pH稳定性曲线(图2)。

图2 α-淀粉酶的pH稳定性Fig.2 Effect of pH on the stability of the α-amylase

从图2可以看到，B186 1-1 α-淀粉酶在pH值5.5～9.0的范围内基本保持稳定，酶活力在95%以上，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在pH为5.5时，酶活力已经降至64%；在pH 5.0下放置1 h，B186 1-1 α-淀粉酶保留80%以上酶活力，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶仅保留约10%酶活力；当pH<5.0时B186 1-1 α-淀粉酶活力迅速减小，在pH 4.5～5.0缓冲液下于37 ℃保温1 h，还能保持50%以上的酶活力，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶就基本检测不到活性了。和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶相比，B186 1-1 α-淀粉酶有更好的pH稳定性。

2.4 B186 1-1 α-淀粉酶在酸性pH条件下的活力有所提高

用pH 3.0～9.0的PBS缓冲液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用不同pH的PBS缓冲液稀释酶液，采用1.7的方法在80 ℃条件下测定酶液在不同pH环境中的相对酶活力，得到pH对B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580α-淀粉酶酶活力的影响曲线(图3)。

从图3可以看到，pH对酶活力的影响较大，在pH值为7.0时，B186 1-1 α-淀粉酶和ATCC14580 α-淀粉酶都能发挥最大活性，2种酶的最适作用pH为pH 7.0；pH在6.0～7.0范围内，B186 1-1 α-淀粉酶可保留90%以上的酶活力，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在pH为6时，酶活力已经降至80%； pH 5.0时，B186 1-1 α-淀粉酶可保留30%左右的酶活，而ATCC14580 α-淀粉酶，就基本已经检测不到活性了。

图3 pH对酶活力的影响Fig.3 Effect of pH on the activity

2.5 B186 1-1 α-淀粉酶的最适反应温度与热稳定性发生显著变化

用pH 6.0的PBS缓冲液配制1.0%的可溶性淀粉底物，用1.7的方法测定30 ℃～100 ℃的相对酶活力，得到温度对B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶酶活力的影响曲线(图4)。

图4 温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity

由图4可知，B186 1-1 α-淀粉酶的最适反应温度为80 ℃，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶的最适反应温度为75 ℃。温度小于80 ℃时，随着温度的升高酶活力都慢慢上升；温度大于80 ℃时，随着温度的上升酶活力都急剧下降；温度为30～95 ℃时，B186 1-1 α-淀粉酶可保留50%以上的酶活力，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在95 ℃时，酶活力已经降至20%；温度为100 ℃时，该淀粉酶保留了约40%的酶活力，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶仅保留15%左右的酶活力。与模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶相比，B186 1-1 α-淀粉酶的温度作用范围更广。

进一步研究其热稳定性，用pH 7.0的PBS缓冲液配制1.0%的可溶性淀粉底物，将酶液分别在60、65、70、75、80 ℃下保温1 h，每隔10 min取样，冰浴30 min后，用1.7的方法在80 ℃条件下测定处理后各酶液的相对酶活力，得到B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶的热稳定性曲线(图5)。

图5 α-淀粉酶的热稳定性Fig.5 Effect of temperature on the stability of the α-amylase

从图5可以看出，B186 1-1 α-淀粉酶在60 ℃和65 ℃条件下比较稳定，保温1 h后酶活力都能保留90%以上，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在60 ℃和65 ℃条件下保温1 h后酶活力仅剩分别为35%和10%左右； B186 1-1 α-淀粉酶70 ℃条件下保温1 h后酶活力约为80%，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在70 ℃条件下保温20 min后就检测不到酶活力了；当温度在75 ℃和80 ℃时，B186 1-1 α-淀粉酶活性的半衰期为分别为50 min和20 min，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶此条件下10 min不足10%。与模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶相比，B186 1-1 α-淀粉酶的热稳定性有很大的提高。

2.6 α-淀粉酶编码基因的序列分析与3D结构模拟分析

将菌株B186 1-1来源的BLA编码基因进行核苷酸序列测定，与模式菌株14580来源的BLA编码基因进行序列比对，由图6可知二者的核苷酸序列中的存在A12T、C72T、G401T、T729G、T939C、G958T等6个核苷酸碱基的差异，进一步对其演绎的氨基酸序列进行比对分析(图7)，其相应的成熟肽中K4N、R134L、D243E、A320S等4个位点存在差异。

图6 BLA编码基因核苷酸序列比对Fig.6 The nucleotide sequences alignment of BLA encoding gene

图7 BLA编码基因氨基酸序列比对Fig.7 The amino acid sequences alignment of BLA encoding gene

通过Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org)获得其3D结构模型(图8和图9)。通过对模型进行观察知，K4N和D243E两个位点位于α-螺旋上，A320S和R134L两个位点位于β-折叠上。推测这些位点对其酶学性质有相关性，尤其是提升了BLA在酸性条件下的pH的稳定性。后续将进一步通过定点突变及饱和突变进一步探究这些位点对酸性条件下pH稳定的影响，为改造工业应用属性的BLA奠定生物信息学基础。

图8 B186 1-1 α-淀粉酶的3D结构模型Fig.8 The 3D structure model of B186 1-1 α-amylase

图9 ATCC14580 α-淀粉酶的3D结构模型Fig.9 The 3D structure model of ATCC14580 α-amylase

3 结论

通过对1株产BLA的pH稳定性能提高的地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶的分析鉴定，采用分子克隆技术克隆与序列分析了其编码基因并对其重组酶的相关性能进行了分析。本论文的研究结果可为BLA工业属性的人工进化奠定基础。

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Biochemical characterization ofBacilluslicheniformisα-amylase mutant with improved acidic pH stability

LUO Dan1, JIN Xiao1, NIU Dan-dan1*, XIE Yin-zhu2,LIN Juan1,YE Xiu-yun1

1 (Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering, College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116,China)2 (National Engineering Laboratory for High-Efficiency Enzyme Expression，FudaBioTech Co． Ltd，Fuzhou 350002,China)

The pH stability ofBacilluslicheniformisα-amylase (BLA) has important value in its manufacturing by a fermentation process, especially at downstream recovery stage, improvement of recovery yield, easy storage conditions and extended shelf life of enzyme product. In the present studies, the cloning, sequence analysis and biochemical characterization of an α-amylase gene fromB.licheniformisstrain B186 1-1, a wild type isolate with BLA activity and improved pH stability were reported. In comparison withB.licheniformisATCC 14580, four residues were different, including N4K, R134L, E243D and S320A. This BLA was then expressed in Escherichia coli and the recombinant enzyme was prepared and purified to SDS-PAGE-grade purity. The biochemical properties of the recombinant enzyme were investigated. The recombinant enzyme exhibited the highest activity at 80 ℃ and pH 6.0-7.5 and retained more than 80% of the activity after incubating at pH 5.0 for 1 h, which is significantly improved compared with BLA fromB.licheniformisATCC14580 retaining only about 10% of the enzyme activity. The 3D structure prediction and analysis were further performed and the relationship between the mutated amino acid residues and acidic pH stability was discussed.

B.licheniformisα-amylase; natural mutant; pH stability; enzymatic properties

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705004

硕士研究生(牛丹丹为通讯作者,E-mail：ddniu0529@fzu.edu.cn)。

福建省教育厅产学研项目(JA15049)；国家自然科学基金(31601407)；福建省自然科学基金(2016J01157)；福州大学人才基金(XRC-1564)

2016-012-13，改回日期：2017-02-17