干酪乳杆菌胞外多糖基因簇的调控基因在大肠杆菌中异源表达

孔令慧，周炜，王光强，夏永军，张汇，李红梅，艾连中，熊智强*

1(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)2(扬州市扬大康源乳业有限公司，江苏 扬州,225004)

干酪乳杆菌胞外多糖基因簇的调控基因在大肠杆菌中异源表达

孔令慧1，周炜2，王光强1，夏永军1，张汇1，李红梅1，艾连中1，熊智强1*

1(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)2(扬州市扬大康源乳业有限公司，江苏 扬州,225004)

为研究干酪乳杆菌胞外多糖的生物合成和转录调控，对其生物合成基因簇中假定的转录调控因子LC2W_2170进行克隆，并在大肠杆菌(Escherichiacoli)中异源表达。首先，利用PCR技术从干酪乳杆菌LC2W中扩增出目的基因LC2W_2170，将其插入到大肠杆菌表达载体pET24a和pET30a中，构建出LC2W_2170 N端或C端和N端均含有His蛋白标签的重组质粒。含上述质粒的E.coli经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析并未发现LC2W_2170蛋白可溶性表达。对LC2W_2170氨基酸序列利用Phobius服务器分析，发现该蛋白N端存在跨膜区(前27个氨基酸为跨膜序列)。切除此跨膜区域重新构建重组表达质粒后，在E.coli中成功实现LC2W_2170蛋白可溶性表达。研究为进一步纯化该转录调控因子，并研究其功能和对胞外多糖生物合成基因簇的转录调控机制奠定了基础。

干酪乳杆菌；胞外多糖；转录调控因子；异源表达；大肠杆菌

乳酸菌是一类能利用碳水化合物并产生大量乳酸的细菌总称，属于革兰氏阳性菌，不产芽孢，在自然界中分布广泛，从各种植物的表面、人畜禽类的肠道和腌制食品等环境中都能检测到它的存在，在食品和医药领域应用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属和乳酸乳球菌属等。例如，干酪乳杆菌具有很高的乙醇耐受力[1]，能够很好地适应恶劣环境。它具有能够改善人体肠道微环境[2-3]，调节机体免疫力，抗过敏，调节血压和降低胆固醇等[4]重要生理活性。目前乳酸菌的研究重点主要是其发挥作用的机理，比如它的次生代谢产物细菌素和胞外多糖(EPS)[5]如何在调节肠道平衡中发挥着重要作用。

乳酸菌EPS是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的黏多糖或荚膜多糖[2,5-6]。EPS被广泛应用于食品和医药等行业，可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂、脂肪替代品和水黏合剂等[7-8]。在发酵过程中有助于改善发酵的流变学特性，减少发酵乳乳清析出现象，改善发酵乳质地和感官质量等[9]。此外，干酪乳杆菌产生的EPS对自发性高血压大鼠和肾性高血压大鼠都具有明显的降血压作用[10-11]。由于乳酸菌EPS的这些重要功能，展开乳酸菌EPS的生物合成和调控机制研究具有重要意义。

随着许多重要的乳酸菌全基因组序列公布和EPS合成相关基因簇的克隆及功能分析，使得利用基因工程和代谢工程技术提高EPS的产量成为可能[7,13-15]。通过其生物合成的机制研究，可阐明其代谢过程中关键因素[16]，大量的研究已经证明EPS生物合成途径中必需的一些基因和相对应编码的酶。例如，eps基因簇在乳酸乳球菌中过表达，能显著提高EPS的合成。在此基础上，对产EPS的乳酸菌进行改造修饰和调控也取得了一定的进展[16]。本研究基于对干酪乳杆菌LC2W基因组数据分析的基础上[17-18]，发现该菌EPS基因簇中含有一个假定的途径特异性转录调控因子LC2W_2170，关于此调控因子的研究尚未见报道，对它在EPS生物合成中可能的调控作用尚不清楚。为了解LC2W_2170在转录水平上如何调控EPS生物合成，纯化此蛋白展开凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)等体外基因表达调控研究非常有必要。因此，本文对LC2W_2170进行克隆，并在E.coli中异源表达，为该蛋白进一步的分离纯化、功能鉴定和对EPS生物合成调控机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

实验所用的菌株与质粒如表1所示。

表1 本研究所使用的菌株与质粒

1.1.2 培养基

MRS(g/L)：细菌蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，柠檬酸氢二胺2，葡萄糖20，乙酸钠8.3，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，吐温-80 1 mL。115 ℃灭菌20 min。固体培养基另加琼脂粉20。

LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。121 ℃灭菌15 min。固体培养基另加琼脂粉20。

1.1.3 试剂与仪器

质粒提取、PCR纯化试剂盒购自Axygen；限制性内切酶、T4连接酶、IPTG、高保真酶以及DNA marker购自大连宝生物公司；卡那霉素等购自上海生工；蛋白试剂盒购自康为世纪。电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪，购自Bio-Rad公司；冷冻离心机，购自Sigma公司；厌氧培养箱，购自RUSKINN公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物设计

根据NCBI数据库中干酪乳杆菌LC2W的LC2W_2170基因完整序列，设计引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 PCR扩增所用的引物及其序列

1.2.2 重组质粒pKLH01和pZX100的构建

以干酪乳杆菌基因组为模板，用LC2W_2170-F/LC2W_2170-R和LC2W_2170-R/LC2W_2170-F1两对引物分别进行PCR扩增转录调控因子LC2W_2170。扩增条件：95 ℃预变性3 min，98℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃，10 min。PCR产物进行凝胶电泳检测，并用纯化试剂盒回收。LC2W_2170-F/LC2W_2170-R纯化产物和pET24a分别用NdeI和XhoI双酶切，纯化回收；LC2W_2170-R/LC2W_2170-F1和pET30a分别用EcoRI和XhoI双酶切纯化回收，16 ℃，连接1 h。将连接产物转化至E.coliTop10，提取质粒双酶切验证正确后送上海生工测序，测序成功的重组质粒分别命名为pKLH01和pZX100，转化至E.coliBL21(DE3)，涂布在含有卡那霉素(Kan)的LB固体培养基平板上进行筛选。

1.2.3 IPTG浓度对蛋白可溶性表达的影响

将质粒pET24a、pKLH01和pZX100转化至E.coliBL21(DE3)，将含有重组质粒的BL21(DE3)接种于4 mL含卡那霉素(Kan)的LB液体培养基(kan终浓度为50 μg/mL)中，37 ℃，200 r/min培养过夜。以1%的接种量接种于新鲜LB培养基中，培养至OD600约0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，37℃，200 r/min 诱导表达3 h。

取菌液1 mL，12 000 r/min离心1 min，弃上清，无菌水重悬后取80 μL菌液，加入20 μL上样缓冲液后于100℃煮沸5 min，离心取上清至新1.5 mL EP管，-20 ℃冷却备用。取上述样品，进行SDS-PAGE分析(采用康为世纪SDS-PAGE试剂盒)，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。电泳结束后凝胶染色2 h，将脱色后的凝胶用Bio-Rad凝胶成像系统照相。

1.2.4 不同温度对蛋白可溶性表达的影响

细胞培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，分别在28 ℃和37 ℃诱导，收集菌体，按1.2.3方法进行SDS-PAGE分析。

1.2.5 不同菌株对蛋白可溶性表达的影响

将pET24a、pKLH01和pZX100分别转化至E.coliC43(DE3)和E.coliRosetta(DE3)中，培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，37℃诱导3 h，收集菌体，按1.2.3方法进行SDS-PAGE分析。

1.2.6 切除跨膜区域对蛋白可溶性表达的影响

1.2.6.1 切除跨膜区域重组质粒的构建

以干酪乳杆菌基因组为模板，用引物Tru_orf2170-F/LC2W_2170-R1和Tru_orf2170-F1/LC2W_2170-R1两对引物分别进行PCR扩增LC2W_2170基因。扩增条件：95 ℃预变性3 min,98 ℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，30个循环，72 ℃，10 min。PCR产物进行凝胶电泳检测，并用纯化试剂盒回收。Tru-orf2170-F1/LC2W_orf2170-R1和pET30a分别用EcoRI和XhoI双酶切纯化回收；Tru-orf2170-F/LC2W_orf2170-R1纯化产物和pET30a分别用NdeI和XhoI双酶切，纯化回收，16 ℃，连接1 h。将连接产物转化至E.coliTop10，提取质粒双酶切验证正确后送上海生工测序，测序正确的质粒分别命名为pKLH12和pKLH11。

1.2.6.2 重组质粒pKLH11和pKLH12的表达

将pET24a、pKLH11和pKLH12转化至E.coliBL21(DE3)，培养至OD600约为0.6时，加入IPTG分别至终浓度为0、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，37 ℃，200 r/min 诱导表达3 h，收集菌体，按1.2.3方法进行SDS-PAGE分析。

2 实验结果

2.1 重组质粒pKLH01和pZX100的构建

干酪乳杆菌中存在与EPS合成有关的基因簇，并且该基因簇中存在一个假定的转录调控因子LC2W_2170。本实验以LC2W基因组为模板，利用PCR扩增出目的基因LC2W_2170，预期条带大小为897 bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示(图1A)，在750 bp与1 000 bp之间有明显特异性扩增条带，片段大小与理论预期值一致。

将扩增出的目的基因LC2W_2170经酶切后分别连入表达载体pET30a和pET24a，转化至E.coliTop10，挑取阳性转化子过夜培养后提取质粒，进行酶切鉴定。结果显示(图1B)双酶切获得1条约800 bp及1条约5 400 bp的条带。前者与插入片段大小一致，后者与pET24a和pET30a大小相一致，2种重组质粒经酶切和PCR扩增鉴定正确。

对重组质粒进一步通过测序来进行鉴定，经过软件分析比对，结果表明：插入片段的序列同NCBI中公布的结构基因序列完全一致，且插入方向和读码框架均正确无误，表明目的基因LC2W_2170正确插入到了pET24a和pET30a载体中，成功构建了C端含有His-tag的重组质粒pKLH01及C端和N端都含有His-tag的重组质粒pZX100，重组质粒结构图(图1C)。

(A)目的基因LC2W_2170的克隆；M：DNA marker DL 2000；1：pZX100质粒中LC2W_2170；2：pKLH01质粒中LC2W_2170。(B)重组质粒双酶切验证；M：DNA marker DL 10000；1：pZX100质粒双酶切结果；2：pKLH01质粒双酶切结果；3：pZX100质粒电泳结果；4：pKLH01质粒电泳结果。(C)表达载体结构示意图；T7 promoter：T7启动子；RBS：核糖体结合位点；His-tag：组氨酸纯化标签；LC2W_2170：LC2W_2170基因；Terminator：终止子图1 LC2W_2170蛋白表达重组质粒构建与验证Fig.1 Construction and validation of recombinant plasmid of LC2W_2170

2.2 不同条件对重组蛋白可溶性表达的影响

为研究转录调控因子LC2W_2170性质和功能，将pZX100和pKLH01转化至E.coliBL21(DE3)、C43(DE3)和Rosseta(DE3)中进行蛋白表达，分别在28 ℃和37 ℃两种温度，以及在不同IPTG浓度(0、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L)下诱导下。LC2W_2170蛋白分子量约为30 kDa，但通过SDS-PAGE分析(图2)，各泳道中25～35 kDa之间与对照组泳道1相比，并无明显蛋白表达，表明LC2W_2170蛋白在E.coli中并未可溶性表达。

M-蛋白marker；1-pET24a(对照)；2-pKLH01，未加IPTG诱导表达；3-pKLH01，0.2 mmol/L IPTG诱导表达；4-pKLH01，0.4 mmol/L IPTG诱导表达；5-pKLH01，0.6 mmol/L IPTG诱导表达；6-pKLH01，0.8 mmol/L IPTG诱导表达图2 不同条件对LC2W_2170重组蛋白表达的影响Fig.2 Effect of different conditions on the expression of LC2W_2170

2.3 切除跨膜区域对蛋白表达的影响

2.3.1 切除跨膜区域重组质粒构建与验证

为解决LC2W_2170蛋白在E.coli中未表达问题，我们对此蛋白进行了序列分析。利用Phobius服务器(http://phobius.sbc.su.se)对LC2W_2170蛋白氨基酸序列分析，发现该蛋白N端存在跨膜区(前27个氨基酸为跨膜序列，图3A)，所以很可能是此跨膜区影响了蛋白表达。利用NCBI蛋白质保守结构域搜索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)显示(图3B)，LC2W_2170蛋白的保守结构域(如Cps2a保守结构域)并不包括跨膜序列。因此，截去跨膜区并不影响LC2W_2170蛋白的功能。由于前面的实验用E.coli并没有成功表达LC2W_2170蛋白，所以尝试去除此蛋白的跨膜区来提高表达。设计引物PCR扩增不含此跨膜区域的LC2W_2170目的基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示(图3C)，在800 bp附近出现单一条带，与目的片段大小相符。

将PCR产物插入表达载体后，提取重组质粒酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示(图3D)双酶切获得1条800 bp及1条约5 400 bp的片段，与预期结果相符合，表明目的基因已经连接到载体pET30a上，分别构建C端含有His-tag及C端和N端均含有His-tag的重组质粒pKLH11和pKLH12(图3E)。将重组质粒送测序鉴定，测序结果再次证明重组质粒构建成功。

2.3.2 切除跨膜区的LC2W_2170重组质粒在大肠杆菌中表达

将切除跨膜区域重组表达质粒pKLH11、pKLH12以及对照pET30a转化至E.coliBL21(DE3)，37 ℃培养至OD600约为0.6时，加入不同浓度(终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)的IPTG诱导后，进行SDS-PAGE分析。发现所有IPTG浓度都能诱导蛋白表达，不管是C端含有His蛋白标签的pKLH11，还是C端和N端均含有His蛋白标签的pKLH12，在30 kDa处有明显的表达蛋白条带(图4A和4B)，并与预测的LC2W_2170蛋白大小相当。而未诱导的含重组质粒的转化菌以及未诱导的含pET30a质粒的转化菌(对照)都无目的蛋白条带，说明此蛋白条带的出现与IPTG的诱导密切相关，而不是宿主菌本身的蛋白。同时也表明该蛋白在之前条件下未表达，是由于此蛋白跨膜区域的存在影响了其在E.coli中的可溶性表达。

(A)pKLH11蛋白表达结果；M蛋白marker；1：对照pET30a；2：未加IPTG诱导蛋白表达；3：0.2 mmol/L IPTG 诱导蛋白表达；4：0.4 mmol/L IPTG诱导蛋白表达；5：0.6 mmol/L IPTG诱导蛋白表达；6：0.8 mmol/L IPTG诱导蛋白表达。(B)pKLH12蛋白表达结果；M蛋白marker；1：对照pET30a蛋白表达；2：未加IPTG诱导蛋白表达；3：0.2 mmol/L IPTG 诱导蛋白表达；4：0.4 mmol/L IPTG诱导蛋白表达；5：0.6 mmol/L IPTG诱导蛋白表达；6：0.8 mmol/L IPTG诱导蛋白表达图4 切除跨膜区LC2W_2170蛋白在大肠杆菌中表达Fig.4 Truncated LC2W_2170 expression in E.coli

3 讨论

乳酸菌能够促进消化，有利于营养物质的摄取，在机体肠道内产生有机酸、细菌素和EPS等益生因子，从而维持肠道平衡、增强生物屏障功能和减少疾病的发生[19]。EPS在乳酸菌胞内生物合成的效率普遍偏低，目前其调控机制研究鲜有报道，这些已成为制约其在食品工业中应用的重要因素。

利用基因工程改造是提高乳酸菌EPS产量的重要途径[20-21]。例如，在干酪乳杆菌LC2W中，通过过表达NADH氧化酶基因，发现可以显著增加EPS产量[15]。STINGELE等成功地将嗜热链球菌Sfi6的EPS合成基因簇转入乳球菌MG1363中，使乳球菌能高效表达嗜热链球菌EPS[22]。VAN KRANENBURG等通过在乳酸菌内高效表达参与EPS合成的糖基转移酶，显著地提高了EPS的产量[23]。但目前并没有利用基因工程方法对乳酸菌EPS生物合成中调控蛋白进行研究，因此展开乳酸菌EPS生物合成中调控蛋白功能研究，对进一步了解乳酸菌EPS的生物合成和调控机制研究具有重要意义。

为研究乳酸菌EPS生物合成中调控蛋白功能，对其蛋白表达纯化是展开体外功能研究的先决条件。本文以干酪乳杆菌LC2W的EPS基因簇中途径特异性转录调控因子LC2W_2170为研究对象，采用最常用的E.coli蛋白表达系统进行蛋白表达，其中E.coliBL21(DE3)是以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，pET系列载体是利用E.coliT7噬菌体的转录体系为元件构建的高效表达载体，也是目前最有效的E.coli表达载体。研究表明，在C端或者是N端含有His-tag目的蛋白易于表达，并且能够增加目的蛋白的表达量[24]，同时也有利于后续对重组蛋白的纯化。因此，本文构建了C端或N端含有His-tag重组质粒来表达LC2W_2170。但是将构建好的重组质粒转化至E.coli表达宿主中，无论是改变温度，采用不同IPTG诱导浓度、不同表达宿主，和选择不同诱导时间，LC2W_2170蛋白都未成功实现可溶性表达。

为实现LC2W_2170蛋白的成功表达，我们对此蛋白的氨基酸序列进行分析，发现其N端存在跨膜区，可能造成蛋白在E.coli表达时跨膜信号肽翻译不完全等问题[25]。因此，本文对其N端跨膜区(前27个氨基酸为跨膜序列)采用了截短策略，去除跨膜区后的重组质粒在E.coliBL21(DE3)中成功实现LC2W_2170蛋白可溶性表达。本研究不仅可为其他具有跨膜结构的调控蛋白在E.coli中表达作为一个成功范例，还为纯化该转录调控因子，研究其功能及其对胞外多糖生物合成基因簇的转录调控机制奠定了基础。

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Heterologous expression of the transcriptional regulator in the exopolysaccharides gene cluster fromLactobacilluscaseiinEscherichiacoli

KONG Ling-hui1, ZHOU Wei2, WANG Guang-qiang1, XIA Yong-jun1, Zhang Hui1,LI Hong-mei1, AI Lian-zhong1, XIONG Zhi-qiang1*

1(School of Medical Instrument and Food Engineering, University ofShanghaifor Science and Technology, Shanghai 200093, China)2(Kangyuan Dairy Co. Ltd, Yangzhou University, Yangzhou 225004, China)

To study biosynthesis of exopolysaccharides (EPS) and its transcriptional regulation, the putative transcriptional regulator, LC2W_2170, of EPS biosynthetic gene cluster fromLactobacilluscaseiwas cloned and expressed inE.coli.LC2W_2170 gene from the genome ofL.caseiwas amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vector pET24a and pET30a with His-tag fused to the N-or C- and N-terminus of LC2W_2170. However, the target protein LC2W_2170 cannot be expressed inE.coliafter isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. Through analyzing the amino acid sequence of LC2W_2170 using Phobius server, there was a trans-membrane region at the N- terminal (the first 27 amino acids) of LC2W_2170. LC2W_2170 protein was successfully expressed inE.coliBL21 (DE3) after removal of the trans-membrane region. These results would be helpful for protein purification and transcriptional regulation of exopolysaccharides biosynthesis gene cluster.

Lactobacilluscasei; exopolysaccharides; transcription regulator; heterologous expression;Escherichiacoli

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705002

博士研究生(熊智强副教授为通讯作者,E-mail：xiongzq@hotmail.com)。

国家自然科学基金(31371809)；新世纪优秀人才计划(NCET-13-0901)；上海市曙光计划项目(15SG42)；中国科学院合成生物学重点实验室开放课题

2016-12-05，改回日期：2017-02-07