嵌合突变嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶结构域B对酶学性质及功能的影响

谷海涛，李松，陈阿娜

1(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖，241000)2(江苏诺泰生物制药股份有限公司，江苏 连云港，222000)

嵌合突变嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶结构域B对酶学性质及功能的影响

谷海涛2，李松1*，陈阿娜1*

1(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖，241000)2(江苏诺泰生物制药股份有限公司，江苏 连云港，222000)

为考察嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)普鲁兰酶结构域B对热稳定性及其他酶学特性和功能的影响，采用嵌合蛋白技术将B.acidopullulyticus普鲁兰酶的结构域B置换为Geobacillusthermoleovorans普鲁兰酶结构域B。嵌合突变体在60 ℃下的半衰期由34.9 min提高至168.4 min，解折叠一半时的温度由65 ℃提高至72 ℃，嵌合突变体较野生型具有更加优良的动力学稳定性和热动力学稳定性。结构域B置换后，最适pH碱向偏移至pH6.5，最适温度提高至70 ℃。比酶活及底物特异性实验结果显示，嵌合突变削弱了酶分子与普鲁兰多糖的结合，转而有利于与糊精及可溶性淀粉的结合。淀粉糖化结果显示，嵌合突变不影响突变体的实际应用性能。上述结果表明，B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B对酶蛋白酶学性质影响显著，可通过同源置换构建适合于不同淀粉糖化工艺的突变体。

嵌合蛋白；普鲁兰酶；结构域B；酶学特性；淀粉糖化

普鲁兰酶是一种双向催化酶，能够催化普鲁兰多糖、淀粉等多聚葡萄糖类底物分支部位的α-1,6-糖苷键的水解[1-3]，特定条件下也能催化α-1,6-糖苷键的反向合成[4-7]，因而可应用于糖苷化合物分子结构解析、淀粉原料糖化以及功能糖化合物合成等诸多领域[8]。当前该酶被广泛地应用于淀粉糖工业中，成为高品质糖浆生产过程中的关键酶制剂[9-10]。淀粉糖化过程需要在高温(60 ℃)下进行，糖化时间一般为48～60 h，普鲁兰酶必须具备在高温下保持较高酶活性和稳定性的能力，筛选或通过分子改造构建耐高温普鲁兰酶对于淀粉糖化过程中降低使用成本和改进工艺具有重要意义[11-12]。

嵌合型蛋白质(Chimeric protein)是利用基因工程技术，将一个蛋白质分子的部分序列插入或取代另一个蛋白质分子的序列所产生的、兼有两种原来蛋白质序列和特点的新蛋白质[13-14]。近年来一些研究将嵌合蛋白技术应用于蛋白质功能改造上，取得了较好的效果[15-18]。普鲁兰酶隶属于α-淀粉酶家族，该家族结构域B位于TIM-桶状结构的第3个β-折叠和第3个α-螺旋之间，参与形成活性口袋和TIM-桶壁，在不同酶中的大小和结构差异较大。通过定点突变和随机突变结果表明该部位在淀粉酶中可能相对比较脆弱，与酶的总体稳定性关联密切，其中部分氨基酸的改变对酶的热稳定性和pH稳定性影响较为显著[19-20]。

来源于G.thermoleovorans的I型普鲁兰酶具有极好的耐热性，在较低浓度的钙离子(0.1 mmol/L)存在条件下，75 ℃下的半衰期为4 h[21]。G.thermoleovorans普鲁兰酶与B.acidopullulyticus普鲁兰酶(PulA)具有36%的氨基酸同源性，结构域B处的氨基酸同源性更是高达44.7%。本课题设计将PulA的结构域B替换成G.thermoleovorans普鲁兰酶的结构域B(GTPB)，构建嵌合型蛋白质(PulA-GTPB)，以提高PulA热稳定性，并考察嵌合突变对其他酶学性质的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

E.coliBL21(DE3)和质粒pET28a(+)-PulA为本实验室保存和构建，PulA为B.acidopullulyticus普鲁兰酶编码基因(GeneBank Accession No. Ax203843.1)；G.thermoleovorans普鲁兰酶结构域B编码基因(GeneBank Accession No. AJ315595.1)由Invitrogen(上海)贸易有限公司合成，并连接于pMD18-T simple vector上。嵌合型质粒命名为pET28a(+)-PulA-GTPB

1.2 嵌合型基因的构建

嵌合型基因的构建采用定点突变试剂盒Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent公司，美国)进行。为提高实验成功概率，不进行单次结构域置换，并将该过程分2步进行：首先，删除PulA结构域B基因(1672-1785)，引物采用P1和P2；经测序删除无误后，插入G.thermoleovorans普鲁兰酶结构域B基因(1039-1152)，采用引物P3和P4进行插入序列的扩增(表1)。所需分子操作及程序参数参照试剂盒说明进行。

表1 插入突变的引物序列

1.3 培养基和培养条件

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0。改良型TB培养基(简称为M-TB，g/L)：胰蛋白胨12.0，酵母粉24.0，甘油10.0，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 12.55，pH 7.0。

种子培养条件：取-80℃保存的菌种按0.1%的接种量接入LB培养基中，置于摇床上37 ℃，230 r/min培养10 h。发酵培养条件：取种子培养液按1%的接种量接入M-TB培养基中，置于摇床上37 ℃，230 r/min培养5.5 h(此时的OD600约为5～6)；加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L，并下调诱导温度至20 ℃，诱导目标蛋白表达，诱导时间20 h[22]。

1.4 生物量的测定

菌浓(OD600)采用没有接种的培养基作空白，将发酵液用培养基适当稀释(OD600在0.2～0.8)，用可见分光光度计检测发酵液在600 nm处的吸光度值。

1.5 粗酶液制备、酶蛋白纯化及定量

取1.0 mL发酵终点的发酵液，4 000 r/min，4 ℃离心30 min。将离心所得菌体用10 mmol/L PBS(pH 7.4)稀释至OD600= 4.0～5.0后，用超声破碎方法破碎菌体。超声条件为25%功率，超2 s停2 s，总超声时间6 min。将超声破碎液10 000 r/min，4 ℃离心10 min，离心上清即为粗酶液。

目标蛋白C端连接His-tag，纯化采用Ni+柱亲和层析方法。纯化及定量具体操作参见文献[23-24]。

1.6 酶活分析

普鲁兰酶酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸方法(简称DNS方法)。取适当稀释的酶液0.1 mL加入到1.9 mL 1%的普鲁兰溶液中，置于60 ℃水浴中温浴10 min，迅速加入3 mL DNS试剂终止酶解反应，并于沸水浴中煮沸7 min进行显色反应。将上述反应液置于冰水中冷却，并加入20 mL蒸馏水，混匀后于540 nm测定吸光度值。采用pH5.0的醋酸-醋酸钠配制1%的普鲁兰溶液。1个酶活力单位定义为上述测定条件下，每分钟释放1 μmol还原糖所需的酶量(还原糖以葡萄糖为标准计)。

1.7 动力学稳定性和热动力学稳定性

动力学稳定性以半衰期(t1/2)表示，测定时将酶液在60 ℃温浴，每隔一定时间取样测定残余酶活。以未经温浴的酶液酶活作为100%，其余酶活以相对百分比表示。以ln (残余酶活%) 对温浴时间作图，采用线性回归方法求得一级反应速率常数kd，半衰期t1/2= ln2/kd。

热动力学稳定性以蛋白质溶解温度(Tm)表示，测定采用圆二色谱仪进行。解折叠曲线测定条件：222 nm，温度变化范围20～90 ℃，蛋白质溶解在5 mmol/L醋酸钠缓冲液中(pH 5.0)，蛋白质质量浓度控制在50 μg/mL。

其余酶学特征参数(最适pH及最适温度、动力学参数、底物特异性)及淀粉糖化水解效果测定方法参见文献[25]。

2 结果与分析

2.1 嵌合突变对菌体生长和酶催化性能的影响

嵌合蛋白是一种杂合蛋白，有可能兼具两亲本特点，也有可能因蛋白序列发生变化引起蛋白质构象发生改变或不能正确折叠而失去原蛋白性能[26-28]。嵌合型质粒pET28a(+)-PulA-GTPB构建成功后，转化E.coliBL21(DE3)。发酵终点时，菌体生物量(OD600)与野生型PulA无明显差别，表明嵌合型蛋白对菌体生长没有影响(相对于野生型)。

然而，酶活测定结果表明嵌合突变对总酶活力的影响显著，诱导20 h后嵌合型普鲁兰酶的总酶活力仅为野生型普鲁兰酶的47%。比酶活测定结果显示，嵌合型PulA-GTPB的比酶活力是野生型PulA的43%(表2)。SDS-PAGE结果显示2者可溶性表达量相近(图2)。嵌合型蛋白PulA-GTPB对普鲁兰多糖的催化性能下降，嵌合突变影响了酶蛋白对α-1,6糖苷键的水解功能。

表2 野生型普鲁兰酶及其嵌合突变体总酶活及比酶活

M-蛋白质分子量(kDa)标准；样品为单位菌体细胞破碎上清；箭头所指之处为目标蛋白所在位置；1-PulA-GTPB；2-PulA图2 野生型及其嵌合突变体SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of PulA and PulA-GTPB

2.2 嵌合突变对热稳定性的影响

半衰期实验结果显示60 ℃时嵌合突变体及野生型普鲁兰酶酶活损失一半所需的时间分别为34.9 min和168.4 min，嵌合突变体半衰期是野生型普鲁兰酶的4.8倍。60 ℃温浴30 min后嵌合突变体能保留初始酶活的95%，而野生型在同等条件下的残余酶活仅为55%(图3-A)。

通过研究嵌合突变体及野生型普鲁兰酶的溶解温度，进一步研究两者在热动力学稳定性(Thermodynamic stability)上的差异。Tm实验结果显示嵌合突变体及野生型普鲁兰酶解折叠一半时的温度分别为72.0℃和65.0℃(图3-B)。结果表明突嵌合变体具有比野生型更加优良的热稳定性。

(A)t1/2；(B) Tm图3 野生型及其嵌合突变体的半衰期及溶解温度Fig.3 The t1/2 and Tm of PulA and PulA-GTPB

2.3 嵌合突变对最适pH及最适温度的影响

野生型普鲁兰酶最适pH为pH5.0，嵌合突变体最适pH为pH6.5，G.thermoleovorans普鲁兰酶结构域B使得嵌合酶最适pH碱向偏移。表明结构域B与酶的最适pH及酸碱稳定性密切相关(图4-A)。嵌合突变体的最适温度为70 ℃，较野生型提高了10 ℃。反应温度为60 ℃时，相对酶活为70 ℃时的85%。反应温度高于60 ℃时，仍能保持较高的相对酶活。如在80 ℃时，嵌合突变体的相对酶活为78%，而野生型普鲁兰酶的相对酶活仅为34%。表明嵌合突变体比野生型具有较好的耐热性(图4-B)。

(A) 最适 pH；(B) 最适温度图4 野生型及其嵌合突变体的最适pH及最适温度Fig.4 The optimal pH and optimal temperature of PulA and PulA-GTPB

2.4 嵌合突变对酶促动力学参数的影响

动力学参数的测定在60 ℃，pH 5.0下进行，以普鲁兰多糖为底物，测定纯酶在不同底物质量浓度下的初始反应速率。通过非线性回归方法求得Vmax和Km，kcat=Vmax/[E]，其中[E]是酶浓度[29]。与突变前相比，嵌合突变体的Km值上升明显，嵌合酶对普鲁兰多糖底物的亲和力(Km)下降，催化效率仅有野生型的51%(表3)。

表3 野生型普鲁兰酶及其突变体动力学参数

2.5 嵌合突变对底物特异性的影响

以普鲁兰多糖、糊精、可溶性淀粉和牡蛎糖原为底物，对比考察嵌合突变对底物特异性的影响。用于测定底物特异性的底物浓度为0.25%。以普鲁兰多糖为底物时的酶活计为100%，其余酶活以相对百分比表示。实验结果显示，PulA-GTPB和PulA的最适底物均是普鲁兰多糖，且对高度分支的糖原没有水解活性。然而，PulA-GTPB对糊精和可溶性淀粉的水解活性较野生型PulA有明显上升(表4)。结合比酶活测定结果(嵌合突变体对普鲁兰多糖的催化性能下降明显)进一步证实GTPB削弱了酶分子与普鲁兰多糖的结合，转而有利于酶分子与糊精、可溶性淀粉等底物结合。

表4 野生型普鲁兰酶及其嵌合突变体底物特异性

注：-表示酶活在检测线以下。

2.6 嵌合突变对淀粉糖化应用性能的影响

为考察嵌合突变对淀粉糖化实际应用效果的影响，以干基浓度为30%的玉米淀粉乳(按15L配制)为底物，经高温酸性α-淀粉酶液化后，再加入糖化酶(120 U/g干基)和普鲁兰酶进行糖化。由于嵌合突变体PulA-GTPB的比酶活只有野生型PulA的43%，当按照0.5 U/g干基添加普鲁兰酶时，突变体的添加量是野生型的2.3倍。以只添加糖化酶的实验组作为对照，测定各组料液中DE值(还原性糖以葡萄糖计)。糖化终点时，对照、野生型PulA和嵌合突变体PulA-GTPB糖化值分别为92.1%、93.6%和95.2%，复合酶糖化效果比只添加糖化酶的糖化效果好，嵌合突变体比对照和野生型糖化效果好。

等量嵌合突变体对普鲁兰的催化活力虽只有野生型的43%，但是对糊精的催化能力较野生型有显著提升(表5)，因而实验采用固定添加普鲁兰酶酶活单位的方式添加嵌合突变体，最终突变体的糖化效果优于野生型。为进一步降低应用成本，采用固定添加量的方式添加普鲁兰酶：野生型仍按0.5 U/g干基添加，嵌合型的理论添加量为 (0.5×43%) U/g干基。糖化终点时嵌合突变体PulA-GTPB糖化值为93.3%，与野生型相比无本质差异。该结果表明，嵌合突变不影响淀粉糖化实际应用性能(表5)。

表5 野生型普鲁兰酶及其突变体糖化效果

注：DE1固定添加酶活；DE2固定添加重量

3 结论

采用嵌合蛋白技术将B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B置换为G.thermoleovorans普鲁兰酶结构域B，研究嵌合突变对B.acidopullulyticus普鲁兰酶热稳定性及其他酶学性质的影响。得出以下结论：与野生型相比，嵌合突变体的热稳定性大幅提高，较好地弥补了比酶活下降的不足，因而不影响淀粉糖化应用性能。此外，嵌合突变对最适pH、最适温度、酶促动力学参数及底物特异性亦有显著影响。上述结果表明B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B对酶蛋白酶学性质影响显著，研究结果可为普鲁兰酶定向分子改造提供依据，相关机理有待进一步研究。

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Effect of chimeric mutation ofBacillusacidopullulyticuspullulanase domain B on its enzymatic characteristics and functions

GU Hai-tao2,LI Song1*,CHEN A-na1*

1(School of Biochemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, China)2(Sinopep Jiangsu Inc., Lianyungang 222000, China)

Chimeric protein technology was used to replace domain B ofBacillusacidopullulyticuspullulanase with domain B fromGeobacillusthermoleovoranspullulanase to investigate the effects of chimeric mutation on thermostability, enzymatic characteristics, and function. The results showed that the half-life of chimeric mutant at 60 ℃ was increased from 34.9 min to 168.4min, and its melting temperature increased from 65 ℃ to 72 ℃. Furthermore, chimeric mutant had more excellent kinetic stability and thermodynamic stability compared to wild-type enzyme. The optimal pH and optimal temperature were 6.5 and 70 ℃, respectively after domain B replacement. Specific activity and substrate specificity results showed that the chimeric mutation weakened the combination of enzyme with pullulan, increased the combination of enzyme with dextrin and soluble starch. Starch saccharification results showed that the chimeric mutation did not affect the practical application. These results demonstrated thatB.acidopullulyticuspullulanase domain B had significant impact on enzyme properties. The mutants suitable for different starch saccharification processes can be constructed by homologous replacement.

chimeric protein;pullulanase; domain B; enzyme properties; starch saccharification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705008

本科生(李松副教授、陈阿娜副教授为本文通讯作者，E-mail：lisong821123@126.com；chenanan@ahpu.edu.cn)。

安徽省自然科学基金青年基金项目(No. 1708085QC63；No. 1408085QC61)国家自然科学基金项目(No. 31401630)

2016-09-21，改回日期：2016-12-28