Microtox（微毒）技术应用于参附注射液综合毒性检测＊

罗荔敏，鄢良春，侯新莲，华桦，干建伟，赵军宁＊

（1.华润三九（雅安）药业有限公司雅安625000；2.四川省中医药科学院成都610041）

Microtox（微毒）技术应用于参附注射液综合毒性检测＊

罗荔敏1＊＊，鄢良春2＊＊，侯新莲1，华桦2，干建伟1，赵军宁2＊＊＊

（1.华润三九（雅安）药业有限公司雅安625000；2.四川省中医药科学院成都610041）

目的：探索Microtox技术应用于独家品种-参附注射液综合毒性检测。方法：以费氏弧菌为测试菌种，通过方法学考察确定最优检测体系及方法学可靠性；在最优检测体系条件下，首次以费氏弧菌对某药厂独家品种参附注射液进行发光菌综合毒性检测。结果：2 mL反应体系下，最优复苏液体积0.9 mL/支菌，每个待测样品加入最优菌液体积50 μL，最优检测时间为10 min，pH为5-10，且10 min发光强度80-120万；重复性试验、中间精密度试验的RSD，均符合测定要求。9批次待测参附注射液EC50值无显著性差异（41.07%，RSD＜5%）。结论：参附注射液对费氏弧菌的毒性存在显著的浓度-效应关系，且不同批次之间成品EC50值无显著性差异，说明参附注射液不同批次之间质量波动性较小，生产工艺控制力较强。

Microtox技术发光细菌参附注射液综合毒性

参附注射液是根据宋代著名医家严永和“参附汤”，运用现代化提取技术手段改剂型制成的中药注射剂，由红参、附子两味药材组成。该注射剂主要功效为回阳救逆，益气固脱，主要用于阳气暴脱的厥脱证，如感染性、失血性或失液性休克等；也可用于阳虚（或气虚）所致的惊悸、怔忡、喘咳、胃痛、泄泻及痹证。参附注射液为华润三九（雅安）药业有限公司的独家品种，先后被国家药监局列为“国家中药保护品种”，国家中医药管理局列为首批“全国中医院急诊室必备中成药”，荣获2013年度国家科技进步奖二等奖、四川省科技进步奖一等奖等荣誉，是年销售额规模10亿元以上的中药注射剂大品种，同时是中华人民共和国卫计委重大疫情诊治推荐品种[1-3]。

赵军宁等[3]于2010年提出新型中药质量控制模式的思路与方法-“功效-毒性-物质”，结合传统中药功能主治与现代化药理、毒理及药物化学研究成果，建立了新型多指标质量控制与评价的方法体系。本研究探索将Microtox技术运用于参附注射液综合毒性评价，为辅助该品种质量控制提供理论依据。

1 主要仪器与试药

BHP9514发光菌测试仪（北京滨松光子技术股份有限公司）。费氏弧菌复苏稀释液、费氏弧菌渗透压调节液（北京滨松光子技术股份有限公司，批号分别为：20150820、20150820）；纯化水。

费氏弧菌冻干粉试剂盒（菌种型号：CS234，菌种批号：D15G030-D15G055，北京滨松光子技术股份有限公司），-20℃避光保存。参附注射液，微黄色至淡棕色的澄明液体（华润三九（雅安）药业有限公司，9批次）。

2 实验方法

2.1 发光强度测定方法

费氏弧菌冻干粉1支（-20℃菌保存），室温（18-25℃）平衡15 min，加入0.9 mL复苏液，于室温下放置10 min，作为测试用菌液。将待测样品用纯化水稀释至合适的浓度，用渗透压调节液（17：3）混匀，此为待测样品溶液。每次试验均采用采用复苏稀释液作为空白对照。每支测试管中放入2 mL待测样品或空白对照液（n=3），分别向各测试管中加入50 μL测试菌液，轻轻震荡混匀，室温放置10 min后，用滨松发光菌测试仪读取各管发光强度值，并记录。

2.2 方法学考察

2.2.1 不同测定方法影响因素考察

（1）考察复苏液体积、加入菌液体积及时间对空白对照初始发光强度值的影响

首先将平衡后的费氏弧菌冻干粉中分别加入0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL复苏液进行复苏，10 min后分别取每个复苏液体积下的菌液20、30、40、50、60 μL至装有2 mL稀释液的空白对照管中（n=3），轻轻震荡3-4次至混匀后开始计时，每2 min测定1次发光强度值，比较不同复苏液体积、不同菌液加入量及不同测定时间对空白对照管初始发光强度值的影响。

（2）考察时间对不同浓度待测样品发光强度值的影响

向待测管中加入2 mL不同浓度下待测样品溶液（n=3），后用移液器加入最优复苏参数条件下测试菌液，轻轻震荡从混匀开始计时，每隔2 min测定1次发光强度值，比较不同浓度待测样品发光强度值随时间的变化情况。

（3）考察pH对待测样品发光强度的影响

用NaOH溶液或HCl溶液与复苏稀释液以适宜的比例混合，配制pH为1、2、4、5、8、10、11、12、14的复苏稀释液；分别取上述复苏稀释液2 mL于测试管中（n= 3），加入50 μL测试菌液，轻轻震荡使之充分混匀开始计时，每2 min测定1次发光强度值，比较pH对发光强度的影响。

2.2.2 重复性、精密度的考察

重复性考察：以“2.1”项下的方法对华润三九（雅安）药业有限公司的参附注射液成品进行检测，每批样品平行3次试验，对结果进行分析。

中间精密度考察：①不同人员：以“2.1”项下.1的方法由不同的实验员在同一个工作日对同一批参附注射液成品进行检测，对结果进行分析；②不同工作日：由相同的实验员在不同工作日对同一批参附注射液成品进行检测，对结果进行分析。

2.3 费氏弧菌——参附注射液综合毒性评价

按照“2.1”项下的方法，对华润三九（雅安）药业有限公司的9批次参附注射液成品进行发光强度检测并计算抑制率和EC50值（抑制率为50%时该样品的浓度值），根据EC50值对比各样品的综合毒性大小（EC50值与各样品综合毒性呈负相关）。

2.4 数据处理和毒性评价

采用Excel对数模型拟合样品浓度-效应曲线，根据拟合模型计算样品的EC50值（抑制率为50%时该样品的浓度值），以EC50值表征参附注射液综合毒性的大小，并对9批次数据求算平均值（Average）、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD），P＜0.05表示无显著性差异。抑制率计算公式如下：

其中，A代表平均发光强度。

3 结果

3.1 各因素对注射剂发光强度的影响

由图1可见，相同的菌液体积，复苏液不同体积会造成初始发光强度值随时间的走势不同，随复苏液体积增大初始发光强度值呈现先增高后降低趋势；相同的复苏液体积，菌液体积不同会造成初始发光强度值随时间的走势不同，随所加菌液体积增大初始发光强度值亦呈现先增高后降低趋势；结合上述试验结果为减小试验误差同时考虑成本问题，选取最优复苏液体积0.9 mL，每管加菌液体积50 μL，10-30 min内发光强度值基本没有太大变化可用于试验测定（初始发光强度值在80-120万之间为宜）。

由图2可见，不同浓度的参附注射液对费氏弧菌初试发光强度值的影响不同，低浓度促进发光，高浓度抑制发光，且中间浓度抑制率在15 min左右开始发生衰减。综合空白对照管的结果，设定参附注射液-费氏弧菌综合毒性评价体系参数为：复苏液0.9 mL，每管加入菌液50 μL，最优检测时间10 min。由图3可见，待测样品溶液pH在5-10时对发光强度值的影响较小（变化幅度为10%以内）。

3.2 精密度考察

根据表1可见，重复性试验的相对偏差小于15%。根据表2可见，中间精密度试验的相对偏差小于15%。

3.3 9批次参附注射液综合毒性比较

由表3和图4可见，9批次参附注射液成品EC50值差异不大，平均值为41.07%，标准偏差1.74%，相对标准偏差4.25%（P＜0.05）。

图1 复苏液体积、加入菌液体积及时间对空白对照管初始发光强度值的影响

图2 时间对不同浓度待测样品发光强度值的影响

图3 pH对发光强度的影响

4 讨论

利用发光菌生理上的独特性，Microtox技术根据发光强度的变化检测生物毒性，也是目前GB/T15441-1995和ISO11348认证的急性毒理测试方法。细菌有很多种类，但是他们的发光原理是相同的，都是酶促氧化反应。一般主要有荧光素酶、FMN、NAD（P）H、长链脂肪醛（RCHO）、分子氧等物质参与发光反应。在正常的生理条件下发光菌能发出波长在450-490 nm的蓝绿色可见光，发光强度在特定试验条件下是恒定的；发光强度在接触外来受试物时会发生变化，外来受试物抑制细菌发光主要通过2个途径：①直接抑制酶类参与发光反应的活性；②抑制与发光反应有关的细胞内代谢过程。原理图如下[4]：

该技术评价体系优点如下：①发光菌具有同高等生物类似的物理化学性质和酶作用过程特点，模拟性强，是一种综合毒性检测方法；②该方法为国际公认的客观可靠的方法，且方法简单，便于操作，重复性好；③反应灵敏度高，比一般生物反应细胞灵敏几个数量级；④可以同时获得多个定量参数，EC50、标准毒物参比值、毒性剂量-效应动力曲线等多个定量参数的测定，综合表征上述注射剂毒性特点[5-13]。

表1 3批参附注射液成品重复性试验

表2 中间精密度试验

表3 9批次参附注射液成品生物综合毒性结果

图4 9批次参附注射液成品生物综合毒性结果

图5 发光菌发光代谢过程和原理图

1何青青,沈美华,肖光华.参附注射液的应用概况.中国中医急症, 2012,21(11)：1808-1811.

2刘晓霞,秦义红,韦玮.参附注射液的临床应用概述.天津药学, 2013,25(3)：63-65.

3中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.戈登热治疗指南.中国新药与临床药理,2016,27(1)：138-142.

4Meighen E A.Molecular biology of bacterial bioluminescence.Mol Bio Rev,1991,55(1)：123-142.

5赵军宁,鄢良春.基于Microtox技术(微毒测试)的中药综合毒性快速评价.世界中医药,2014,9(2)：137-144.

6赵军宁,鄢良春,郑晓秋.一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法.中国：ZL201310210195.8.

7赵军宁,鄢良春,朱雅宁,等.一种快速检测红花注射液综合毒性的生物测试方法.中国：ZL201410113782.X.

8赵军宁,鄢良春,郑晓秋,等.一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法.中国：ZL201310369652.8

9李孝容,华桦,鄢良春,等.苍耳子微毒测试(Microtox)与小鼠急性毒性的相关性研究.中药药理与临床,2 016,32(2)：134-138.

10夏见英,华桦,鄢良春,等.基于Microtox技术快速检测苍耳子药材及其饮片、成方制剂毒性变化规律.中药药理与临床,2016,32(2)：151-154.

11熊静悦,李孝容,鄢良春,等.Microtox中药注射剂微毒测试体系明亮发光杆菌502和青海弧菌Q67发光反应条件的比较研究.中药药理与临床,2016,32(2)：227-230.

12郑晓秋,鄢良春,赵军宁,等.应用Microtox技术检测鱼腥草注射液综合毒性的研究.中药药理与临床,2013,29(6)：92-95.

13熊静悦,李孝容,鄢良春,等.基于Microtox技术的中药注射剂微毒快速测试体系反应条件的优化与方法学的考察.中国中药杂志, 2016,41(9)：1622-1626.

Microtox-based Fast Testing Method of Comprehensive Toxicity of Shen-Fu Injection

Luo Limin1,Yan Liangchun2,Hou Xinlian1,Hua Hua2,Gan Jianwei1,Zhao Junning2
(1.China Resources Sanjiu Pharmaceutical Co.,Ltd.,Ya’an 625000,China; 2.Sichuan Academy of Chinese Medical Sciences,Chengdu 610041,China)

In this research,Microtox technology was used to evaluate the comprehensive toxicity of Shen-Fu injection, which was an exclusive product of the pharmaceutical company.Firstly,vibrio fischeri was used as test strain.The best test system and methodology were identified.Under the best test conditions,vibrio fischeri was firstly used in the luminescent bacteria comprehensive toxicity of the exclusive product Shen-Fu injection.The results showed that in the 2mL reaction system,the best recovery liquid volume was 0.9 mL/freeze-dried vial,50 μL bacterial suspensions/ sample,the detection time was 10 min after adding bacterial suspensions,the pH was 5-10,the luminous intensity was 800 000-12 000 000 for 10 min.The RSD of replication experiment and intermediate precision test was?and?, respectively,which fitted to the requirements.There was no significant difference on EC50values among 9 batches of tested Shen-Fu injection(41.07%,RSD＜5%).It was concluded that there was significant concentration-effect relationship between Shen-Fu injection and the toxicity of vibrio fischeri.There was no significant difference on EC50values among different batches.It indicated that there was small quality volatility among different batches of Shen-Fu injection.The control on product manufacturing was strong.

Microtox technology,luminescent bacteria,Shen-Fu injection,comprehensive toxicity

10.11842/wst.2017.03.018

R285

A

（责任编辑：陈宁，责任译审：王晶）

2017-02-17

修回日期：2017-03-11

＊科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09501004-001-005）：基于Microtox（微毒）测试的中药安全性快速检测、质量控制与风险预警新技术研究，负责人：赵军宁；四川省科技厅科技创新团队项目（2017TD0003）：中药毒性生物评价研究四川省青年科技创新研究团队—中药毒性生物评价研究，负责人：鄢良春；国家自然科学基金委面上项目（81470180）：基于Microtox技术的中药毒性分级原理与标准研究，负责人：赵军宁；四川省科技厅重大科技成果转化项目（2012SC0015）：中药大品种参附注射液技术成果转化，负责人：郝莉。

＊＊罗荔敏、鄢良春为共同第一作者。

＊＊通讯作者：赵军宁，本刊副主编，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药药理学、中药质量生物控制、道地药材与民族药系统研究开发等。