中药研发和评价思路与方法探讨＊

孙建宁，董世芬

（北京中医药大学中药学院北京100102）

中药研发和评价思路与方法探讨＊

孙建宁，董世芬

（北京中医药大学中药学院北京100102）

中药复方研发既有中医理论指导，又有长期临床应用经验为依据，显示出独特的价值。同时，中药复方中与临床疗效相关的物质基础复杂多样、作用环节繁多等是中药的特点。现代中药新药发现需要基于中医理论和临床特色，注重整体作用特点和现代生物医学技术密切结合。中药新药研发和评价的关键问题是，用符合中医药临床特点的实验方法学体系来揭示方剂功能主治和证的现代科学内涵。在研发过程中，从立项依据到药效毒理研究均应考虑中药的特点。而且，药效研究应注意加强证候特点的体现，其中证候模型和病症结合模型的研究和应用、方证相应的研究方法、与中药功效相对应地生物学指标的确认等均至关重要。我们要抓住中医药振兴发展的历史机遇，加快中药优势领域药物研发，以大力促进中医药现代化创新进程。

中药复方研发药效研究证候模型方证相应

2016年，国务院在《中国的中医药》白皮书中提出：“中医药在历史发展进程中，兼容并蓄、创新开放，形成了独特的生命观、健康观、疾病观、防治观，实现了自然科学与人文科学的融合和统一，蕴含了中华民族深邃的哲学思想。随着人们健康观念变化和医学模式转变，中医药越来越显示出独特价值”[1]。同年，张伯礼院士在中国中医科学院2016科技创新大会上的工作报告中提出：“坚持深化改革，完善体制机制；坚持协同创新，促进内涵发展；坚持继承创新，发挥特色优势；坚持需求导向，解决关键问题”。近年来，中医药在国家政策的支持下，在广大中医药科研人员的努力下欣欣向荣。随着药品研究、研发和审评不断推进和深化，中药评审遇到诸多困难，解决这些难题的关键在于能否从中药自身的研究方法和思路进行突破，以解决关键问题。

1 中药研发和评价技术平台

国家“十二五”规划纲要明确提出：中药研发需要基于中医药理论，以中医临床为导向，探索符合中医药特点的研究方法，构建现代新药发现和评价的技术体系。基于中医理论和临床特点的现代中药新药发现模式需要基于中药整体作用特点和现代生物医学理论和技术的中药筛选方法进行研究。由此可知，开展适合中药多成分和复杂作用特点的中药评价技术研究是目前的重要课题[2]。

2 中药开发研究的特点和现状

中药开发研究具有中医学理论指导及长期临床应用经验，辨证论治是中医药临床应用优势与突出特色。但在中药开发研究面临的实际问题较多，比如：①以临床导向为核心的立项依据不够充分；②中药功效、疗效特点体现不足，难以判断是否能支持临床研究；③基础研究薄弱，多成分作用靶点和机理研究尚不充分。

3 药物研发过程中药效毒理研究的意义

中药效毒理研究是中药新药研制与开发重要环节。首先，现代科学最基本的方法是动物实验方法，可获得大量在人体无法获得的信息，确保中药的有效性、安全性。并且，中药效毒理论研究可以为立项论证提供依据，主要措施包括：①经验方立项依据首先要重视的是该方的临床应用经验总结、疗效特点及安全信息、现拟定处方和工艺的合理性；②开展全方和组方中饮片的文献研究综述，以提示临床定位的合理性和有效性；③研发团队早期的实验研究资料也作为立项依据的部分；④各方面材料的综合分析评价形成完整的立项依据，来支持研发的必要性、创新性、合理性。

4 临床前药效学研究的关键问题

目前，中药研究难度较大的是功效研究，因此需要丰富和发展符合中医药临床特点的实验方法学体系来揭示方剂功能主治和证的现代科学内涵——方证相应。其中，包括了整体实验中的动物模型、生物学指标和细胞实验。

4.1 加强证候模型的研究和应用

目前，在一些动物证候模型中很难找到与临床诊断类似的指标。因此，寻找证候产生的主要生物标志物成为评价证候模型的关键。在证候理论研究的基础上，引入先进的研究理念和技术，探究疾病发生发展的生物学本质，寻找证候产生的主要生物标志物，解决作用于复杂生命体的具有复杂化学体系的方、药的干预实质，发挥方、药的临床作用。据统计，现有的证侯模型有60多类（600多种），涉及130多种疾病。然而，证候模型的研究还存在以下3方面问题：①施加的中医造模因素与临床实践相去甚远；疾病组与施加中医因素组没有差别或差别甚微；②病证模型没有进行客观评价，只凭主观判断；或有评价，但评价标准混乱，得不到公认；③把疾病因素与证侯表现分离，没有有机结合。自发性高血压模型以前只用于高血压病的研究，现在研究发现自发性高血压模型幼鼠的神经系统发育状态和行为表现与儿童注意力缺陷、多动症类似，其21周龄以后与更年期综合征的症候学特点非常相似。

4.1.1Ⅱ型胶原注射结合寒湿/湿热刺激致类风湿性关节炎大鼠病证结合模型

寒湿刺激法复制寒湿型RA大鼠模型是将注射CⅡ大鼠置于动物实验箱中，设定温度5℃，湿度95%，模拟寒湿病因每天刺激8 h，连续6周。湿热刺激法复制湿热型RA大鼠模型：将注射CⅡ大鼠置于动物实验箱中，设定温度35℃，湿度95%，模拟湿热病因。每天刺激8 h，连续6周。目前，寒湿病的观察指标包括：肿胀度踝关节组织病理学、IgG、C反应蛋白、炎性细胞因子等；证候观察指标包括：一般状态（活动度、皮毛、舌色、口唇颜色、心率等）、体温、饮水量、摄食量、体重、cAMP/cGMP、血流变、神经递质等。研究发现，造模前后，大鼠体内的DA、IFN-γ、PDGF-AA、CINC-2α、IL-1、RAGE等指标具有明显差异。

温热性药物在寒湿型类风湿性关节炎大鼠模型上则能有更好的体现。生附子粉对风寒刺激小鼠的LD50高于正常小鼠，而镇痛作用的ED50则低于正常小鼠，说明寒湿模型对附子的有效剂量更敏感。黑顺片对类风湿性关节炎结合风寒刺激大鼠心脏毒性的TD50高于正常大鼠，而关节肿胀的改善作用则优于单纯类风湿性关节炎大鼠，提示证候-毒性-药效之间存在一定相关性[3]。

4.1.2 气虚血瘀证动物模型的构建与评价[4，5]

在小型猪冠脉环术心肌缺血模型的动态评价中，在造模8-12天，出现的血瘀证宏观表征为舌质青紫、舌质RGB值改变、趾蹼间肌肤甲错，精神紧张，皮毛疏松杂乱；微观指标中TNF-α、IL-6和ET表达增加，NO表达减少，服用丹七片后血瘀证症状和指标改善。其中，出现气虚血瘀证模型的宏观表征为摇尾次数减少、活动度降低、抓取反应差，舌质RGB值降低，趾蹼间肌肤甲错、皮毛无光泽，微观中TNF-α、Hcy和MMP-9的表达增加，NO和HO-1表达减少。这与临床气虚血瘀证患者临床表现和生化指标改变相似。

在大鼠左冠脉结扎心肌缺血模型的动态评价中，在造模后7-28天，大鼠气虚血瘀证宏观表征为舌、耳廓、尾、爪甲青紫，舌底静脉迂曲，舌质RGB值下降，呼吸频率减慢、游泳力竭且时间缩短。微观指标中TNF-α、Hcy、MMP-9表达增加，NO和HO-1表达减少。也可以结合代谢组学观察特殊分子群的变化。气虚证大鼠的宏观表征为色舌淡白，呼吸频率下降，活动度下降，游泳力竭时间缩短，抓力下降；微观指标中TNF-α和MMP-9表达增加，NO和APN表达减少。通过与临床证候对比，可加强动物证候模型与临床证候的一致性，从而确保动物模型实验结果的准确性，为证候研究提供理论基础。

冠心病气血血瘀证证候生物学基础以冠心病气虚血瘀证为切入点。通过文本挖掘，结合蛋白组学和代谢组学技术观察临床患者、动物模型的理化指标、蛋白质和代谢物，了解证候的生物学基础。不同种属间气虚血瘀证呈现共性特征分子群，且形成一个相互作用的蛋白网络（37个蛋白质、110对相互作用）ACTB、ACTG1、ACTN4、TUBB等基因为其关键节点。

4.2 揭示方剂功能主治和证的现代科学内涵——方证相应[6，7]

方剂的功效是特定方药与特定病证之间相互作用的结果。体外研究的新思路是采用证候患者的血清刺激RAW264.7细胞，检测Toll样受体（Toll Like Receptors，TLRs）和细胞因子水平，同时采用方药或含药血清进行干预，观察上述指标的逆转作用。TLRs是一类重要的信号转导型结构识别受体，跨膜受体蛋白。TLRs与感染性疾病、心血管疾病、胃肠疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病等的发病有关。TLRs的研究成为生命科学领域的热点，不仅对天然免疫有新认识，还与获得性免疫联系起来，为感染性、炎症性、自身免疫性、肿瘤等疾病的发生，宿主的易感性及治疗提供新思路。“方证对应”试验结果显示桂枝汤证患者血清中TLR-3、TLR-4、TLR-9 mRNA表达增加，血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β表达增加。这是桂枝汤证患者在免疫调节环节中的重要病理基础。

桂枝汤含药血清可完全逆转桂枝汤证患者血清TLRs及其介导产生的细胞因子的水平，具有“适配作用”，符合中医方证相关。桂枝汤证患者TLR-3、TLR-4、TLR 9 mRNA表达减少；IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β表达减少。麻黄汤证患者TLR-3、TLR-4 mRNA表达减少，IL-1β、IL-6水平降低；银翘散证患者TLR-4 mRNA表达减少；IL-1β、IL-6含量降低；桑菊饮证患者TLR-4 mRNA表达减少，IL-1β、IL-6含量降低。与其他方剂对比，可见桂枝汤在最大程度上缓解了桂枝汤证患者血清炎性因子的变化。这样的思路还可用于其他证候学研究中。

4.3 提出与中药功效相对应的生物学指标

2017年度医学科学部重点立项领域中，有3个方向的研究亟待中医药解决，分别为：基于循证医学证据的中医药优势病种防治机制研究；芳香类中药“开窍”或“化湿”物质基础及作用机制研究；代谢紊乱致心肌细胞功能障碍的分子机制及干预。

中药的功效通常为综合性的体现，其内涵不是一、两个指标就可体现，以传统经方名方安宫牛黄丸为例，提出“开窍醒神”功效评价指标界定的问题；另外，方中朱砂、雄黄为有毒中药，出口药必须去除其中的有毒重金属成分，那么重金属成分是否在药效中起作用以及安全性如何，这些内容都需要通过更为精准的证候模型和评价方法研究清楚。首先需指出的是“开窍醒神”功效相关的生物学指标不是单纯的中枢兴奋或镇静，是脑功能的全面改善的综合体现，终点指标以脑电图评价较好。安宫牛黄丸对感染中毒性脑损伤、缺血或出血性脑损伤模型中均表现出显著的改善脑电图（促清醒）作用，主要作用环节涉及神经细胞保护、突触结构重塑、神经发生和血管新生等。对原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用及机理的研究（血清、脑脊液药理）表明：安宫牛黄丸对缺糖缺氧、谷氨酸诱导原代皮层神经元损伤具有保护作用，改善原代皮层神经元线粒体膜电位及[Ca2+]i的含量。安宫牛黄丸醒脑开窍作用的生物学指标如图1所示。

图1 与“开窍醒神”功效相关的生物学指标示例[2]

4.3.1 安宫牛黄丸对脑损伤大鼠脑电活动和突触结构的影响

该项研究结果发现，缺血性及内毒素性脑损伤可引起脑电图β波功率及相对功率降低，δ波相对功率提高，提示模型动物处于意识障碍或昏迷状态。LPS可引起皮层锥体细胞胞体缩小，核固缩，多数细胞核仁消失；导致突触数量的减少，突触超微结构破坏，突触间隙缩窄，突触前膜囊泡大量聚集，突触后膜PSD减少。安宫牛黄丸全方可以使β波功率和相对功率增加，表现脑电激活作用；全方可减轻内毒素引起的皮层锥体细胞胞体缩小及核固缩，减轻细胞损伤；抑制突触前膜囊泡聚集，使突触间隙和PSD增加；并出现意识觉醒和行为活动增加[8]。

4.3.2 安宫牛黄丸对脑损伤大鼠脑血管生成和神经发生的影响

脑缺血第7天，脑皮层、纹状体、侧脑室下区域、海马齿状回区域的神经细胞数目有所增加；安宫牛黄各个剂量可以进一步增加神经细胞数目。对血管生成的影响方面。脑缺血第7天，脑皮层、纹状体血管数目明显增加；安宫牛黄丸可以进一步增加皮层血管数目。

4.3.3 安宫牛黄丸对脑出血大鼠有保护作用

安宫牛黄丸可显著改善神经症状，降低脑指数，提高红细胞变形性，降低LDH活性，提高SOD活性，降低MDA含量，改善组织病理形态。可以减少TUNEL的阳性表达，通过促进Bcl-2表达、抑制BAX表达抗凋亡；通过抑制AQP4、MMP9表达改善血脑屏障通透性，发挥神经保护作用；通过抑制c-fos、c-jun、PKC、P38 mRNA表达，促进ERK mRNA表达，来调节MAPK通路，发挥神经保护作用[9，10]。

去朱砂雄黄后对血脑屏障通透性相关蛋白表达的影响与全方相近，对凋亡的抑制作用有所减弱。但与全方等效剂量进行组间比较无显著性差异；去朱砂雄黄后减少c-fos、c-jun、P38 mRNA的表达作用明显弱于安宫牛黄丸组。朱砂雄黄可能与安宫牛黄丸对MAPK通路的调节作用有关。

这些研究结果表明，“开窍醒神”功效表现在脑功能恢复的多项指标上：促清醒、抗多种脑损伤、促进脑神经血管的再生与发生等作用。去朱砂、雄黄后，多项实验指标作用减弱，特别在促清醒、抗细胞凋亡指标上与全方有显著性差异，提示朱砂、雄黄在全方中的存在是必要的。含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对损伤神经细胞的保护作用的差异与朱砂、雄黄可能相关[8]。

4.4 加快中药优势领域药物研发

2017年度医学科学部重点立项中把代谢紊乱致心肌细胞功能障碍的分子机制及中药干预作为重点。以实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型的建立与评价为例。高糖高脂饲料喂养可增加大鼠的血脂，高糖高脂饲料喂养叠加链脲佐茵素（Streptozotocin,STZ）后可增加大鼠的血脂、血糖，高糖高脂饲料喂养叠加STZ后可降低大鼠的心功能，高糖高脂饲料喂养叠加STZ后可损伤大鼠的心脏结构（图2）。高糖高脂饲料喂养负荷30 mg·kg-1STZ腹腔注射可建立实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型。模型大鼠进食、饮水量增加，体重急剧下降，血糖、血脂和心肌组织脂肪酸含量升高，心脏出现以舒张功能下降为主的心功能减弱，并发心肌肥厚等结构紊乱，与临床2型糖尿病患者发病规律和表现形态相近。高糖高脂饲料喂养12周，能够显著提高大鼠血脂各项指标，而不能提高血糖水平，但是大鼠出现了温和但是显著的心功能障碍和心肌病理损伤，提示高糖高脂饲料喂养出现的肥胖和高血脂是推动糖尿病心肌病大鼠模型发病的重要致病因素[11]。

研究发现，小檗碱可改善糖尿病大鼠心脏结构和功能损伤。高糖高脂饲料喂养负荷30 mg·kg-1STZ腹腔注射可建立实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型。模型大鼠进食、饮水量增加，体重急剧下降，血糖、血脂和心肌组织脂肪酸含量升高，心脏出现以舒张功能下降为主的心功能减弱，并发心肌肥厚等结构紊乱，与临床2型糖尿病患者证侯和表现相近，表现出气阴两虚、阴虚内热证。小檗碱可以显著改善实验性2型糖尿病心肌病。改善大鼠模型的一般状态，降低血糖、血脂水平，改善心脏功能，抑制心肌肥厚和左心室重构，对动物饮食量没有明显的作用。通过抑制模型大鼠PPARα基因以及提高PPARγ基因和蛋白表达，从而提高GLUT4转录，调节大鼠外周循环和心肌中脂肪代谢，增加心肌组织葡萄糖的利用，改善心脏结构和功能损伤。由以上结果得出，小檗碱对于2型糖尿病心肌病的治疗是多靶点综合作用的结果[12,13]。

4.5 创建动物新模型、提出药物研发新策略

图2 高糖高脂饲料负荷STZ注射对大鼠心脏病理结构的影响[16]

中药新药研究如何“坚持继承创新，发挥特色优势”，需继续创建新的疾病和病症结合动物模型，药物的干预是环节的。如抗抑郁药研究，新模型的评价有3个主要原则：①现实有效性，即动物模型与抑郁症的临床特征具有相似性；②建造有效性，即构建动物模型理论的合理性；③预测有效性，即对抗抑郁药物的反应性。抗抑郁药研究的新策略有：NK-1受体拮抗剂、CRF拮抗剂、GR拮抗剂、NMDA受体拮抗剂、AMPA受体增强剂、cAMP信号激活、促进神经生长因子生成等，作用于这些环节的药物起到减少应激物质作用效应、减轻神经元损伤、促进神经元发生的作用，均可具有抗抑郁作用[14，15]。

5 小结

中医药振兴发展迎来了天时、地利、人和的历史性机遇。中医药现代化创新的来源是中医药理论和临床实践及现代科学技术发现和应用，将传统的中医药理论和现代科学体系、技术的结合、整合、融合，可以上升到新的发展高度。

1中华人民共和国国务院新闻办公室.中国的中医药(白皮书),2016.

2孙建宁,孙文燕,董世芬.基于临床用药特点的中药复方新药药效评价思路与方法探讨.中国中药杂志,2017,42(5)：852-855.

3熊海霞,杨颖,靖卫霞,等.病/证状态对附子急性毒性与药效影响探析.世界科学技术-中医药现代化,2013,15(8)：1721-1724.

4刘建勋,林成仁,任建勋,等.痰瘀同治方对痰瘀互结证冠心病小型猪心肌组织的保护作用.中国中药杂志,2014,39(4)：726-731.

5刘建勋,林成仁,任建勋,等.小型猪痰瘀互结证冠心病“痰、毒、瘀”病机演变规律的实验研究.中国中药杂志,2013,38(23)：4138-4143.

6Elshabrawy H A,Essani A E,Szekanecz Z,et al.TLRs,future potential therapeutic targets for RA.Autoimmun Rev,2017,16(2)：103-113.

7Dowling J K,Mansell A.Toll-like receptors：the swiss army knife of immunity and vaccine development.Clin Transl Immunology,2016,5 (5)：e85.

8朱坤杰,孙建宁.朱砂雄黄在安宫牛黄丸对内毒素脑损伤大鼠促清醒中的作用及机制.中国中药杂志,2014,39(20)：4007-4012.

9方芳,冯淑怡,孙建宁.安宫牛黄丸对实验性脑出血大鼠血肿周围组织中MMP-9和AQP-4蛋白表达的影响.北京中医药大学报, 2011,34(8)：535-538,578.

10Wang G H,Lan R,Zhen X D,et al.An-Gong-Niu-Huang Wan protects against cerebral ischemia induced apoptosis in rats：up-regulation of Bcl-2 and down-regulation of Bax and caspase-3.J Ethnopharmacol,2014,154(1)：156-162.

11董世芬,洪缨,孙建宁,等.实验性糖尿病心肌病大鼠模型建立及心脏功能和结构相关性分析,中国实验动物学报,2010,18(6)：457-462,432.

12董世芬,洪缨,汪瑞祺,等.小檗碱对实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型心脏保护作用研究.中国药理学通报,2013,29(9)：1216-1221.

13Dong S F,Hong Y,Liu M,et al.Berberine attenuates cardiac dysfunction in hyperglycemic and hypercholesterolemic rats.Eur J Pharmacol, 2011,660(2-3)：368-374.

14张家玮,孙建宁,张爱林.建立中医证候动物模型与复方药物及其整体调节效应.中国临床康复,2006,10(15)：156-158.

15刘建勋,任钧国.源于中医临床的中药复方功效的现代研究思路与方法.世界科学技术-中医药现代化,2015,17(7)：1372-1379.

Discussion on Research ThoughtAnd Method for Innovation Medicine of Chinese Herbal Compound Formula

Sun Jianning,Dong Shifen
(School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

The Chinese herbal compound formula preparation,which is guided by traditional Chinese medicine(TCM) theories,and based on long-term clinical application,has its unique value.The multi-compound and multi-target characteristics are also features of Chinese materia medica(CMM).The finding and exploration of innovation CMM in modern times should be based on TCM theory and clinical application,as well as the combination of efficacy in the concept of holism and biomedical technology.Key issue in the research,development and evaluation of innovation Chinese medicine is to use to the methodology to illustrate the scientific meaning in according to the clinical application characteristics of Chinese herbal compound formula preparation.During the research and development process, considerations on CMM characteristics should be taken from research evidence,to pharmacodynamics and toxicologystudies.Pharmacodynamics researches should reflect the properties of TCM syndrome.Aspects,such as research and application of TCM syndrome model,correspondence between disease and syndrome model,research method of correspondence between syndrome and prescription,identification of biological markers corresponding to CMM pharmacologic effect,are important.So we should catch up the historical chance for TCM development,speedily develop the advantage areas,and promote the modernization and innovation of TCM.

Research and development of Chinese herbal compound formula,research of pharmacological effect,model of traditional Chinese medicine syndrome,correspondence between syndrome and prescription

10.11842/wst.2017.03.010

R288

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：王晶）

2017-03-01

修回日期：2017-03-20

＊国家自然科学基金委青年基金项目（81503287）：基于苦味受体（Tas2Rs）的“苦逐瘀”生物学物质基础研究，负责人：董世芬；国家自然科学基金委重点项目（81430094）：中药辛/苦味活血化瘀功效的化学和生物学基础研究，负责人：乔延江；教育部博士点基金项目（20130013120002）：基于代谢组学和灰色关联分析的糖尿病心肌病发病规律和药物治疗靶点研究，负责人：董世芬。

＊＊通讯作者：孙建宁，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：中药防治重大疾病创新药物研究。