具有缓释抗菌功能医用泡沫敷料的制备和性能

杜婷婷, 靳向煜

(东华大学 产业用纺织品教育部工程研究中心, 上海201620)

具有缓释抗菌功能医用泡沫敷料的制备和性能

杜婷婷, 靳向煜

(东华大学 产业用纺织品教育部工程研究中心, 上海201620)

以不同长度和用量的超短中空载银聚酯纤维与聚醚型多元醇、异氰酸酯等助剂为原料, 通过一步发泡法制备具有缓释抗菌功能的医用泡沫敷料, 并对各个样品中的纤维分散形态、银离子释放性能、细胞相容性、细胞生长形态以及抗菌性进行测试和分析. 结果表明, 中空载银纤维的添加可使泡沫敷料具有可靠的抗菌性, 且可以通过调整纤维的长度以及用量来控制银离子的释放量, 同时应控制纤维的长径比, 以免造成纤维的缠结, 从而影响银离子的释放, 所有样品均具备优良的细胞相容性, 细胞可在样品上进行生长和延伸.

中空载银聚酯纤维; 医用泡沫敷料; 细胞相容性; 抗菌性

基于伤口湿性愈合理论的发展, 功能性医用敷料不断出现,例如泡沫敷料，其成分为聚醚型聚氨酯,具有优良的生物相容性.另外, 因泡沫敷料独特的多孔结构, 使其具有优良的吸湿性, 常被应用于渗出液较多的伤口护理中, 如腿部溃疡、压疮、Ⅰ度烧伤、浅Ⅱ度烧伤、供皮区伤口、术后伤口和皮肤擦伤的护理[1-2].众多临床试验总结出泡沫敷料具有以下优点: 保持伤口湿润, 不会形成结痂, 加速伤口愈合; 可快速吸收渗液, 减少伤口浸渍; 舒适, 可塑性好, 适合身体各个部位; 敷料更换时无残胶遗留[3].由于伤口渗出液多的创面往往容易感染发炎, 给患者造成极大的痛苦.

目前, 临床上使用的抗菌泡沫敷料通过将抗菌物质直接混入泡沫原料中或将泡沫敷料与其他抗菌敷料进行复合制得, 但在使用过程抗菌物质的释放速度得不到控制, 有时抗菌物质甚至会脱落至创面, 抑制创面正常细胞的生长, 从而影响创面的愈合.因此，开发出具有安全抗菌性能的医用泡沫敷料成了当今敷料的研究热点.

本文利用中空载银聚酯纤维以及泡沫原料，制备一种含有中空载银聚酯短纤维的医用泡沫敷料.银离子因具有广谱抗菌性、除臭性以及低毒性而被广泛应用于医用敷料中[4],而聚酯纤维的化学性能稳定,将其作为银粒子的载体，基本不与伤口渗出液发生反应, 对人体安全、无毒, 并具有良好的力学性能, 目前聚酯纤维已经广泛应用于医疗领域[5].当泡沫敷料吸收创面渗出液后, 泡沫内的中空载银聚酯纤维中的银粒子可通过纤维的两个端口进行缓慢释放, 从而起到抗菌消炎的作用, 避免银离子与创面直接接触的危害.与直接向泡沫敷料中添加抗菌物质相比, 该敷料的抗菌作用更加缓慢和安全.

1 试验部分

1.1 试验原料及仪器

原料: 中空载银聚酯纤维(线密度为5.2 dtex, 中空度为19.26%, 手工切至长度为1、 2、 4 mm), 深圳市洋仟材料应用技术有限责任公司; A料(聚醚型多元醇、水、催化剂、泡沫稳定剂等助剂按照一定比例进行混合的混合料), 美国陶氏化学品公司; B料(异氰酸酯)美国陶氏化学品公司; L-929成纤维细胞、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌, 中国科学院细胞所; 去离子水; 青霉素、链霉素, 上海捷工瑞生物工程有限公司; 胎牛血清、DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培养基, 杭州吉诺生物医药技术有限公司; MTT(噻唑蓝)试剂, 美国Sigma-Ald rich公司;二甲基亚砜(DMSO), 国药集团.

仪器: JB50-S型电动搅拌器, 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司; 电热鼓风干燥箱, 上海圣试电子科技有限公司; FA2004N型天平, 上海方瑞仪器有限公司; PC2810秒表, 义乌市三公文体用品厂; Leeman Prodigy型电感耦合等离子体原子发射仪, 美国Leeman公司; JSM-5600LV型扫描电子显微镜, 日本电子光学公司; 自制海绵切割器和纤维切割器.

1.2 制备工艺

采用一步法进行泡沫敷料的制备[6], 即在高速搅拌下, 将合成泡沫配方中的所有原料以及超短纤维按照一定配比同时进行混合, 使原料之间进行充分反应, 在短时间内完成整个发泡过程, 从而制得具有缓释抗菌功能的医用泡沫敷料.利用自制的电热切割器将所制得敷料切成厚度为5 mm的薄片, 从而制得9种敷料样品.样品的原料混合比例如表1所示.

表1 样品的原料混合比例

具有缓释抗菌功能医用泡沫敷料的制备流程如图1所示.

图1 具有缓释抗菌功能的医用泡沫敷料的制备流程图Fig.1 Preparation process of medical foam dressing with sustained release antibacterial function

由于泡沫的性能以及纤维在泡沫内的分散均匀情况取决于发泡过程中原料黏度、搅拌速度以及熟化温度, 所以在发泡过程中需严格控制发泡工艺参数:tA料=25 ℃,tB料=25 ℃,n搅拌=1 500 r/min,t熟化=60 ℃.

1.3 测试方法

1.3.1 纤维分散形态的观察

将每个样品用导电胶贴在电镜台上, 经喷金处理后, 放入扫描电子显微镜(SEM)中的样品室, 对每个样品表面纤维的形态进行观察.

1.3.2 银离子释放性能的测试

每个样品剪取10 cm×10 cm大小的5块试样, 将每个试样完全浸入一定量的去离子水中, 置于37 ℃水浴锅中, 浸泡时间分别为12、 24、 36、 48、 60 h.然后取出试样, 利用电感耦合等离子体原子发射仪对每个试样浸泡液中银离子的含量进行测试, 5个试样的平均值作为样品的银离子释放量.

1.3.3 MTT比色法

MTT比色法是一种检测细胞在样品上存活和生长情况的方法.由于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中, 而死细胞则无此功能, 因此在一定细胞数范围内, MTT结晶的生成量与细胞数目成正比, 所以可根据样品的吸光度值(OD)间接反映出活细胞的数量[7].

将冻存于-196 ℃液氮罐中的L-929成纤维细胞放置于37 ℃的水浴箱中进行解冻, 再向已解冻的细胞中添加适量含有青霉素、链霉素和胎牛血清的DMEM培养基, 形成细胞悬液, 置于培养瓶中, 放置于37 ℃和5% CO2的培养箱内进行培养.取培养的第三代细胞, 对细胞进行细胞消化处理, 最后将消化好的细胞置于已消毒并干燥好的试样上, 试样的直径为16 mm, 每个试样上种植的细胞数量为1.0×104个.将试样置于37 ℃和5% CO2的培养箱中分别培养1、 3和5 d后, 利用40 μL MTT试剂处理每个试样4 h直至产生紫色沉淀, 再向每个试样中添加400 μL DMSO后, 放置于摇床上溶解沉淀至形成紫色溶液, 振荡时间为30 min.然后使用移液枪分别取100 μL的溶液转移到24孔的培养板中, 并在酶标仪上用570 nm的波段测其吸光度值, 以反映试验过程中细胞的生长及增殖状况.

细胞相对增殖率(RGR)的计算式为(试验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100%, 然后再根据细胞毒性的标准将其转换为细胞毒性等级(CTS), 判断试样是否具有细胞毒性.细胞相对增殖率和细胞毒性的分级关系如表2所示.

表2 细胞相对增殖率和细胞毒性的分级关系表

1.3.4 细胞黏附形态的观察

细胞在试样上分别培养1、 3和5 d后, 利用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗孔板3遍, 以便去除孔中的悬浮细胞.用移液枪在24孔培养板对应孔内加入500 μL的质量分数为5%的戊二醛溶液, 之后将24孔培养板放置冰箱内, 设置温度为4 ℃, 放置时间为2 h, 用以固定细胞在试样上的形态.然后采用酒精对试样进行脱水干燥, 利用梯度法原理, 分别用50%、 70%、 80%、 90%、 95%、 100%的酒精进行脱水处理, 每次的脱水时间为10 min, 而后将样品置于真空干燥箱中过夜.待试样完全干燥后真空喷金, 利用SEM观测L-929成纤维细胞在试样表面的形貌, 从细胞形态的变化判断细胞在样品上的生长情况, 根据表3所示标准判断样品的细胞相容性.

表3 细胞形态分析标准

1.3.5 烧瓶振荡法测试抑菌性能

烧瓶振荡法(shake flask法)适用于检测非溶出型纤维制品的抗菌性能[8].已有试验[9]表明, 细菌悬浮液的吸光度值与其细菌浓度之间呈正相关, 通过测定菌液的吸光度值可以间接反映出细菌的数量.

每个样品剪取10 cm ×10 cm大小的5块试样, 试样经过消毒处理后分别置于三角烧瓶中, 配制浓度为1.5～3.0×105CFU/mL的标准菌液, 向每个三角烧瓶内滴加1 mL的标准菌液, 将每个三角烧瓶至于全温摇瓶柜中, 设定条件为37 ℃, 振荡速度为200 r/min, 振荡时间分别为1和2 d.利用分光光度计测试每个烧瓶在培养1和2 d后的洗脱液在570 nm波段下的吸光度值, 根据式(1)计算出各个样品的抑菌率, 5组试样的平均值作为样品的最终抑菌率.

(1)

其中:A为对照组细菌液的吸光度值;B为各试验组对应细菌液的吸光度值.

2 结果与讨论

2.1 纤维的分散形态

不同长度的纤维在样品内的分散形态, 如图2所示.

(a) 小于1 mm (b) 2 mm

(c) 4 mm (d) 大于4 mm图2 不同长度纤维的分散形态Fig.2 Fiber morphology of different length

由图2中可以看出, 纤维与泡沫之间以点的形式进行黏合, 纤维在泡孔当中悬空, 从泡壁中穿出, 而并不是被泡沫完全包裹着.这是因为纤维与泡沫原料之间的相容性弱, 在纤维的表面容易形成气泡成核点, 在发泡的过程中, 容易在纤维的周围形成泡孔, 这样有利于敷料在使用过程中内部中空载银聚酯纤维与伤口渗出液接触, 有利于银离子的释放, 从而起到有效的抗菌作用.从图2还可以发现：当纤维长度小于1 mm时, 纤维与泡沫的黏合点较少, 且纤维不发生弯曲和变形; 纤维的长度为2 mm时, 纤维大部分为伸直状态, 部分存在“S”型弯曲形态; 纤维长度为4 mm时, 由于软质聚氨酯泡沫切割过程中纤维也有可能被切断, 所以观察到的纤维长度比实际长度短,4 mm的纤维在泡沫中通常呈现“S”型或者“U”型的形态, 由于纤维长度增加, 搅拌过程中纤维受力不均匀, 纤维易产生弯曲；当纤维长度大于4 mm, 纤维之间发生缠结, 不易混入泡沫原料中.

2.2 银离子释放性能

本文所采用中空载银聚酯纤维中的银粒子是利用“银镜反应”原理得到的初生态银粒子, 其抗菌原理如图3所示. 初生态银粒子具有较大的表面自由能, 具有极高的活性, 在潮湿的环境下, 初生态银粒子可转变成Ag+并由中空纤维的两个端口进行释放, 可通过控制纤维的长度以及用量来控制释放端口的数量.相比于直接加银离子以及表面载银的纤维, 中空载银纤维不仅可以减缓银离子释放的速度, 使抗菌性更加长效, 而且避免了银离子直接与皮肤的接触, 使用更加安全.

图3 中空载银聚酯纤维抗菌原理图Fig.3 Schematic diagram of antibacterial property of hollow PET fiber with silver inside

各个样品在不同时间段内的银粒子释放量如表4所示.从表4中可看出：溶液中银离子质量浓度随着时间的延长而增加, 在前12 h内, 银离子的释放速度最快, 12 h后银离子的释放速度趋于平缓, 且在60 h时依然有银离子释放出来; 当纤维的长度一定时, 增加纤维的用量则溶液中的银离子质量浓度随之增加, 但纤维长度为4 mm时, 纤维用量为4 g时银离子的质量浓度却低于用量为2 g时的质量浓度; 当纤维的用量一定时, 溶液中银离子质量浓度随着纤维长度的减短而增加.

表4 不同时间试样银粒子的释放量

造成以上现象的原因是中空载银聚酯纤维的两端开放而中间封闭, 所以银离子只能通过纤维的两个端口进行释放, 在纤维用量相同的情况下, 纤维越短, 则纤维的根数越多, 可释放银离子的端口数越多, 所以银离子的释放量增加.同理, 在纤维长度一定的情况下, 纤维用量越大, 释放端口数也越多, 从而使银离子释放量增加.但由于纤维长度越长, 纤维之间的缠结现象越显著, 使可混入泡沫中的纤维量减少, 且纤维的分布均匀性降低, 所以造成纤维长度为4 mm时, 4 g的纤维用量释放出的银离子低于与2 g纤维用量所释放出的银离子量.

2.3 细胞毒性分析

本试验选用银含量相对最高、居中以及最低的3#、5#和7#作为试验对象, 对照组为空白玻璃片, 试验结果如表5所示.

表5 细胞相对增殖率及毒性分级

从表5可以看出, 细胞在对照组和试验组上培养时, 各组的OD值均随着培养天数的增加而增大, 说明细胞在试样上的数量逐渐增加, 细胞可以在试样上进行增殖.但对比对照组上细胞的OD值可以发现,所有试验组在不同天数的OD值均低于对照组.其原因是泡沫敷料的厚度为5 mm, 由于其独特的泡孔结构, 在向试样上滴加细胞悬液时, 细胞分散于试样厚度方向的各个层面, 在培养过程中细胞不仅在试样的表面上进行增殖分化, 同时在试样的内部进行增殖.当向对照组和试验组滴加等量的MTT溶液时, 对照组玻璃片上的所有细胞可以与MTT充分反应, 而试验组由于厚度较大, MTT溶液瞬间被吸收, 不能充分地与试样各个部位的细胞进行反应形成紫色沉淀.同理, 在进行紫色沉淀溶解时, 由于DMSO溶液被试验组上的样品吸收, 只能溶解部分紫色沉淀, 而对照组上的紫色沉淀可以完全溶解, 所以造成所有试验组的吸光度值都随培养天数的增加而增大, 但却低于对照组的现象.

虽然试样厚度引起细胞分散而使细胞相对增殖率低于100%, 但7#样品与L-929成纤维细胞在体外共培育时, 细胞毒性一直处于1级水平, 且3#和5#样品在培养到第5 d时, 细胞毒性级别最终也到达1级.由此可知, 试样对细胞无毒性, 可以为细胞提供有利的生长环境, 能够促进细胞的增殖分化.

2.4 细胞黏附形貌

图4和5分别为L-929成纤维细胞在3#和7#样品上培养不同天数时的生长形态.由图4和5可以发现，培养1 d的L-929成纤维细胞在样品上大部分呈现圆形； 培养3 d时, 细胞散在或集落状贴附于试样表面, 贴着试样表面铺展开来, 细胞出现不规则的三角形和梭形, 还有部分细胞呈现圆形；7 d 后的成纤维细胞与样品表面有紧密的结合, 并在试样表面生长延展, 大部分都呈现出梭形或是不规则的三角形, 且细胞数量比培养1 d时明显增加.由此说明, 细胞可以在样品上进行生长, 并进行增殖分化, 样品具有良好的细胞相容性.

(a) 1 d (b) 3 d (c) 7 d图4 L-929成纤维细胞在3#上的黏附形态Fig.4 Cell morphology on sample 3#

(a) 1 d (b) 3 d (c) 7 d图5 L-929成纤维细胞在7#上的黏附形态Fig.5 Cell morphology on sample 7#

2.5 抗菌性能分析

表6为烧瓶振荡法抗菌性能测试结果, 其中对照样是没有加入中空载银纤维的泡沫敷料.

由表6可以直观地看出, 分别放有3#、5#和7#试样中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在培养1和2 d时的数量明显少于对照样中的菌数, 说明中空载银纤维的增加赋予了泡沫敷料有效的抗菌性能.由表6还可看出, 3#样品的抗菌性能最强, 其次是5#样品, 7#样品的抗菌性能最低.因为3#样品的银粒子含量最高, 且长度最短, 可释放出银粒子的端口最多, 而7#样品的银粒子含量最低, 纤维长度最长, 所以释放端口最少, 所以3#样品的抗菌性能明显优于5#和7#样品, 由此可知, 在制备具有缓释功能的抗菌泡沫敷料时, 可通过控制中空纤维的用量和纤维的长度来控制试样的抗菌性能.

表6 试样抑菌率测试结果

由过表6还可看出, 随着培养时间的增加, 3个试样的抑菌率也都随之增加, 说明中空载银纤维中的银粒子的释放需要一定的时间, 而不是在短时间内完全释放出来, 从而起到缓释抗菌的功能.

3 结 论

(1) 中空载银聚酯纤维的添加可以使泡沫敷料具有良好的抗菌性能, 且所制备的样品均具有良好的细胞相容性, 说明中空载银纤维可作为一种新型抗菌载体应用于医用敷料中;

(2) 由于银离子从纤维的两个端口进行释放, 可通过调整纤维的长度及用量控制纤维的端口数, 从而控制银离子的释放量, 以达到控制敷料抗菌强度的目的.

[1] 姚鸿,陈立红.伤口湿性愈合理论的临床应用进展[J].中华护理杂志,2008,43(11):1050-1052.

[2] WHITE R, GARDNEN S, CUTTING K， et al. What is the current status of foam dressings[J]. Wounds UK, 2013, 8(3):20-24.

[3] 郑培.泡沫敷料的临床应用研究进展[J].护理研究,2013,27(19):1925-1926.

[4] ASHAVANI K, PRAVEEN KUMAR V, AJAYAN P M, et al. Silver-nanoparticle-embedded antimicrobial paints based on vegetable oil[J]. Nature Material, 2008, 7(3):236-241.

[5] ZHAO J, ZHANG C L, WANG S S. Anti-bacteria polyester fiber[J]. Polyester Industry,2000.

[6] 陈鼎南. 聚氨酯制品生产工艺[M]. 北京：化学工业出版社,2008:13-29.

[7] 杨浩,王春婷,吴玉梅,等. 细胞特性状态及细胞数与OD值的关系探讨[J]. 动物医学进展,2002,23(5):49-51.

[8] 王俊起, 王友斌, 邹海清,等. 抗菌织物测试方法的研究(续)[J]. 纺织标准与质量, 2003(1):26-28.

[9] BOKGI S, BONG Y Y, SANG H S, et al. Antibacterial electrospun chitosan/poly(vinyl alcohol) nanofibers containing silver nitrate and titanium dioxide[J]. Journal of Applied Polymer Science, 2009, 111(6):2892-2899.

(责任编辑：刘园园)

Preparation and Properties of Medical Foam Dressing with Sustained Release Antibacterial Function

DUTingting,JINXiangyu

(Engineering Research Center of Technical Textiles, Ministry of Education, Donghua University, Shanghai 201620, China)

To develop a antibacterial medical foam dressing, a new kind of medical foam dressing was prepared by different length of ultrashort hollow PET(polyester) fiber with silver inside, polyether polyol, TDI (toluene-2, 4-diisocyanate)and other additives, the preparation method of foam dressing was one-step foaming, then the morphology of the fibers, silver release property, cell compatibility, cell growth morphology and antibacterial properties of samples were tested and analysed. The results suggest that adding hollow PET fiber with silver inside can make foam dressing have antibacterial properties, the releases of silver can be controlled by changing the length and amount of fiber, at the same time, the length to diameter ratio of fiber should be controlled in case of snarling to avoid affecting silver release. All the samples have great cell compatibility, cells can grow and extend in the samples.

hollow polyester fiber with silver inside; medical foam dressing; cell compatibility; antibacterial property

1671-0444 (2017)02-0217-07

2015-12-18

东华大学研究生创新基金资助项目(EG2015043)

杜婷婷(1990—)，女，浙江瑞安人，硕士研究生，研究方向为功能性医用敷料. E-mail: m15216784003@163.com 靳向煜(联系人)，男，教授，E-mail: jinxy@dhu.edu.cn

TS 176+.4

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