偏侧咀嚼致大鼠咬肌肌纤维代谢特征改变及其腺苷酸活化蛋白激酶调节机制

石安迪曾林刘静

1.暨南大学口腔医学院；2.口腔修复学教研室，广州 510632

偏侧咀嚼致大鼠咬肌肌纤维代谢特征改变及其腺苷酸活化蛋白激酶调节机制

石安迪1曾林1刘静2

1.暨南大学口腔医学院；2.口腔修复学教研室，广州 510632

目的 探讨偏侧咀嚼对大鼠咬肌肌纤维代谢特征的影响及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）对肌纤维代谢特征变化的调控作用。方法 拔除大鼠右上颌磨牙建立偏侧咀嚼大鼠模型，实验组分为2、4、6、8周组，设同期对照组。应用辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶（NADH-TRase）染色法检测咬肌肌纤维有氧代谢类型以及各型肌纤维的分布密度和构成比；用Western blot技术检测p-AMPK（Thr172）/AMPKα1表达水平。结果 与同期对照组比较，建模2周实验组拔牙侧深染型肌纤维比例增多，非拔牙侧中染型纤维比例增加，浅染型肌纤维比例减少（P<0.05）；建模4、6、8周组双侧深染型肌纤维比例持续增加，拔牙侧显著高于非拔牙侧；第6、8周组双侧中染型肌纤维比例下降（P<0.05）；拔牙侧浅染肌纤维比例在8周组减少，非拔牙侧无明显改变（P>0.05）。p-AMPK（Thr172）/AMPKα1表达水平在2、4周拔牙侧较对照组和非拔牙侧增高（P<0.05），在非拔牙侧各周组无显著改变（P>0.05）。结论 偏侧咀嚼可促进双侧咬肌肌纤维有氧代谢能力且伴随表型特征的改变，在非工作侧更明显；肌纤维有氧代谢能力增强与AMPK通路的激活有关。

辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶； 腺苷酸活化蛋白激酶； 氧化代谢； 偏侧咀嚼

偏侧咀嚼是颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorder，TMD）的致病因素之一[1]，也是临床上常见的咬合紊乱[2]。有研究[3-4]已指出偏侧咀嚼可以导致双侧咀嚼肌结构和肌电发生改变。而此不良咀嚼习惯是否会通过激活细胞通路导致咀嚼肌肌纤维耐疲劳性改变尚不明确。辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶（nicotine adenine dinucleotide tetrazolium reductase，NADH-TRase）是线粒体呼吸链中的递氢体之一，是肌纤维有氧代谢能力和肌抗疲劳性的重要指标。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是细胞内重要能量感受器，调控肌纤维能量代谢和肌纤维表型。

本实验通过建立偏侧咀嚼大鼠模型，了解偏侧咀嚼对双侧咬肌肌纤维耐疲劳性的影响和AMPK信号通路在咬肌肌纤维改建中的作用，探讨偏侧咀嚼导致的咀嚼肌功能紊乱致病机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物选择和分组

选取由南方医科大学实验动物中心提供的8周龄SD雄性大鼠40只，体重200~250 g，许可证号：SCXK（粤）2011-0015。所有大鼠口内检查上下牙列完整，咬合关系基本正常。适应性饲养1周后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 建立动物模型 将40只SD雄性大鼠按照随机数字表法分为4组，分别于建模2、4、6和8周后进行样品采集，每组又分为实验组和对照组，各5只。实验组大鼠经1%戊巴比妥钠（0.004 m L·g-1）腹腔注射麻醉后，呈仰卧位固定于手术板上，以探针分离右上颌磨牙牙龈，止血钳拔除右侧上颌所有磨牙。对照组大鼠不拔牙，其余操作同实验组。

1.2.2 样本制取 大鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定于工作台，心尖灌注生理盐水完全置换血液，双侧咬肌部位备皮，分离、暴露并取出咬肌组织，取双侧咬肌前部约0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小的组织块依次放入4 ℃预冷的20%蔗糖PB缓冲液和30%蔗糖PB缓冲液中至组织沉底以梯度脱水。另取40 mg放入裂解液中（含苯甲基磺酰氟和蛋白磷酸酶抑制剂）在匀浆器中匀浆3 min，后静置冰上裂解30 min，12 000 r·min-1离心10 m in，吸取上清液。

1.2.3 咬肌切片和染色 取组织块稍修整，使肌纤维方向垂直于底座，OCT包埋剂包埋，于-22 ℃恒冷箱切片机中进行冰冻切片，片厚16 μm，室温晾干，进行NADH-TRase染色。在Leica正立电动显微镜下观察肌纤维的染色情况。在200倍光镜下观察，每张组织切片随机选10个视野，采用Image-ProPlus 6.0全自动图像分析系统对各型肌纤维进行计数，并计算各种类型纤维占肌纤维总数的百分率。

1.2.4 Western blot检测 上清液进行考马斯亮蓝液蛋白浓度定量后加入6×十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）上样缓冲液，沸水加热5 m in。上样，SDS-PAGE电泳，至溴酚蓝到达分离胶底部停止电泳。切取相应部位的凝胶浸泡于转移缓冲液中，由下至上按海绵垫、3层滤纸、凝胶、NC膜、3层滤纸、海绵垫放好（NC膜提前5 m in完全浸泡于转移缓冲液中）。夹紧转膜的夹子，按正负极放入转膜盒中，并置入冰盒，调节电流350 mA转膜60 min后停止。NC膜在TBST中清洗3遍后置入5%BSA封闭液中室温下封闭60 m in，用TBST洗3次（每次5 m in），加入抗AMPKα1（武汉博士德生物工程有限公司）、抗p-AMPK（Thr172）单克隆抗体（1︰500稀释），4 ℃孵育过夜，弃一抗，在摇床上用TBST洗3次（每次10 m in），加入羊抗兔、羊抗小鼠（杭州联科生物技术有限公司）二抗工作液（1︰5 000稀释），室温下摇床孵育60 m in，用TBST洗4次（每次8 m in）。加入超敏化学发光液（enhanced chem ilum inescence，ECL）显影，记录结果。

1.3 统计方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，各实验组和同期对照组均数用t检验，各周实验组组间用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 咬肌肌纤维NADH-TRase染色结果

NADH-TRase染色后肌纤维呈蓝色或紫蓝色，根据着色程度可以分为深染、中染及浅染肌纤维。正常大鼠咬肌浅部及中部主要分布有浅染和中染肌纤维，分别约占33%、46%。深部散在分布深染肌纤维，约占21%。各组大鼠咬肌各型肌纤维NADHTRase染色结果见表1和图1。

表 1 各组大鼠咬肌各型肌纤维NADH-TRase染色的构成比Tab 1 Masseter muscle fiber composition in the rats revealed by NADH-TRase staining in each group %,?±s

图 1 偏侧咀嚼大鼠咬肌肌纤维型 NADH-TRase染色 × 200Fig 1 Masseter muscle fiber type of unilateral chew ing rats NADH-TRase staining × 200

各周实验组拔牙侧深染肌纤维含量较对照组和实验组非拔牙侧高（P<0.05），并有逐渐上升趋势。在建模4、8周，实验组非拔牙侧深染肌纤维含量较对照组均有所增高（P<0.05）。2周时实验组非拔牙侧中染肌纤维比例较对照组增高，其余各周实验组大鼠双侧咬肌均较对照组减少（P<0.05）。各周实验组拔牙侧浅染肌纤维比例逐渐下降，于8周组达最低。在非拔牙侧，建模后的浅染肌纤维含量先下降后回升，建模6、8周浅染肌纤维含量与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 咬肌p-AMPK（Thr172）/AMPKα1蛋白表达水平的变化

根据灰度值分析，实验组拔牙侧咬肌p-AMPK（Thr172）/AMPKα1的表达在建模初期2、4周的表达与对照组相比显著增高（P<0.05），而建模后期6、8周组则逐渐减少，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。而实验组非拔牙侧p-AMPK（Thr172）/ AMPKα1的表达则在4、6、8周高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）（图2、表2）。

图 2 Western blot检测AMPKα1、p-AMPK（Thr172）蛋白表达情况Fig 2 Protein expression of AMPKα1 and p-AMPK(Thr172) by Western blot

表 2 各周偏侧咀嚼大鼠咬肌p-AM PK（Thr172）/AMPKα1的相对表达量Tab 2 Relative expression of p-AMPK(Thr172)/AM PKα1 in m asseter m uscle fiber of unilateral chew ing rats in each group

3 讨论

3.1 偏侧咀嚼导致有氧代谢能力的变化

研究发现长期偏侧咀嚼可以导致工作侧咀嚼肌疼痛[5]、头痛[6]，肌电检测双侧咬肌肌电图表现不一致[7]。在青少年时期偏侧咀嚼还可影响面部发育，导致脸部发育不对称[8]。另外工作侧的髁突受到的压力更大，偏侧咀嚼的工作侧关节负担大[9]。口颌系统正常功能的行使有赖于肌肉、关节、咬合的协调，而肌肉作为动力来源，在出现咬合干扰后理论上应较髁突、关节盘先出现改建。

咀嚼肌机械收缩能力又受到肌纤维代谢方式的影响，有氧代谢能力越强肌纤维的抗疲劳性越好。NADH-TRase作为线粒体呼吸链中的脱氢酶，对细胞有氧代谢能力起重要指示作用[10]。肌纤维染色越深，有氧代谢能力和耐力越强，抗疲劳性越好。本实验结果发现建模2周组，非拔牙侧中染肌纤维和拔牙侧深染肌纤维出现明显增加，说明咬合干扰对肌纤维有氧代谢能力的调整在早期即可出现。为了适应增加的咬合负担，功能侧咬肌通过增加混合供能的肌纤维，既增加了肌收缩力又增强了耐力。随着建模时间的延长，第4、6、8周双侧深染肌纤维逐渐增高，并且拔牙侧显著高于非拔牙侧，说明长期偏侧咀嚼导致双侧咬肌氧化代谢能力增加，肌抗疲劳性增加。Douglas等[11]指出咬合干扰是一种运动单位病理性改变。当只有一侧磨牙进行咀嚼，为适应增加的咀嚼负担，咀嚼肌通过上调双侧咬肌有氧代谢为主的肌纤维，增加抗疲劳性，进而增加咀嚼循环进食，这与Honma等[12]的研究结果相符。但是非拔牙侧的增加幅度小于拔牙侧。胡敏等[13]研究也发现一侧后牙缺失的小型猪双侧咬肌Ⅰ型肌纤维增多，其中以拔牙侧增加更明显，与本实验研究结果一致。

本研究在建模8周，拔牙侧浅染肌纤维开始出现减少，说明在拔牙侧由于 干扰持续存在，糖酵解供能为主的肌纤维也将向有氧代谢供能类型肌纤维转化，Scribbans等[14]研究也指出长期耐力运动可导致各型肌纤维有氧代谢能力增高。而非拔牙侧浅染肌纤维逐渐恢复，这与口腔内的感受器反馈调节有关。在建模开始时为了适应新的咬合关系，咬肌通过增加中染肌纤维比例，以更高效率粉碎食物，但是由于功能侧有咬合接触，通过牙周膜、肌梭感受器的调节，肌纤维代谢能力和肌力恢复正常咬合状态，因而各型肌纤维有逐渐恢复原比例的趋势。

3.2 AMPK磷酸化与肌纤维表型关系

肌纤维的表型和代谢能力受到细胞因子的调控。AMPK是近年来备受关注的细胞内敏感能量感受器。当胞内能量大量消耗导致一磷酸腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）︰三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）︰ATP的比例增高和胞内Ca2+增高时可刺激AMPK磷酸化，并通过激活下游调控因子氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α（peroxisome proliferater activated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α），促进线粒体生成、慢肌的转录[15]。同时还有促进胞内葡萄糖摄取、抑制蛋白合成，调控离子通道的作用[15-16]。

王晓慧等[17]研究发现拔牙侧AM PK下游分子PGC-1α的mRNA表达量在偏侧咀嚼建模2、4、8周组明显高于非拔牙侧及对照组。本研究显示拔牙侧AMPK磷酸化程度在2、4周组分别是正常对照组的1.5、1.3倍，与先前研究结果相符，提示非工作侧由于拔牙后丧失咬合接触，在新的咀嚼模式下，下颌活动度在咬合干扰初期增大，导致肌纤维内能量大量消耗，当引起AMP︰ATP比例下降后激活更多的AMPKα1磷酸化，进而促进慢肌的转化、线粒体的合成，因而AMPK磷酸化程度在拔牙侧与深染肌纤维的增加有一致性。但也有不一致的地方，拔牙侧深染肌纤维逐渐增加而AMPK磷酸化程度在6、8周组咬肌并没明显增加，这可能是由于建模早期肌纤维内线粒体增加，有氧代谢能力改善，在建模后期胞内能量补充及时，所以未导致AMP︰ATP的改变。另外和其他通路的调节也有关。王子娴等[18]研究也发现偏侧咀嚼大鼠咬肌CaN在咬肌肌纤维内的变化和Ⅰ型肌纤维的增加有关。在非拔牙侧AMPK磷酸化在各周均无明显增高，分析其原因可能有两点：1）由于非拔牙侧保持原有咬合接触，咀嚼肌运动幅度并未明显增加，肌纤维内能量消耗并没有明显增多，AMP︰ATP比例未改变；2）本实验样本量不足，未得出统计学意义。因而非拔牙侧深染型肌纤维比例虽较对照组增大，但增加幅度较拔牙侧小。

综上所述，本研究通过建立大鼠模型证明偏侧咀嚼对双侧咬肌有氧代谢和抗疲劳性产生影响，导致双侧咬肌有氧代谢能力逐渐增强，并且双侧改变不一致，呈现时间依赖性，这种改变可能与AMPK磷酸化程度激活有关。

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（本文编辑 杜冰）

Alteration of metabolic characteristics on the masseter muscle fiber of unilateral chew ing rats and its adenosine mono-

phosphate activated protein kinase regulatory mechanism

Shi Andi1, Zeng Lin1, Liu Jing2. (1. College of Stomatology,

Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Dept. of Prosthodontics, College of Stomatology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Supported by: Talent Fund of Jinan University(51025036). Correspondence: Liu Jing, E-mail: lxxjing98@sina.com.

ObjectiveThis study aims to determ ine the influence of unilateral chew ing on metabolic characteristics of masseter muscle fibers in rats and the regulatory effect of an adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) signal pathway on metabolism.MethodsRats were subm itted to exodontia of all the right maxillary molars and divided into 2, 4, 6, and 8 weeks groups, and corresponding control groups were set as well. Sections were stained by nicotine adenine dinucleotide tetrazolim reductase(NADH-TRase) to demonstrate the types, proportion, and density of masseter muscle fibers. AMPKα1 and p-AMPK(Thr172) levels in bilateral masseter muscles were detected by Western blot.ResultsIn the 2-week group, the percentage of dark fibers augmented in the ipsilateral side, whereas the percentage of intermediary fibers in the contralateral side was increased accompanied by a decrease of light fibers, compared with the control group (P<0.05). The percentage of dark fibers was increased in the bilateral sides, whereas the percentage of dark fiber in the ipsilateral sides surpassed that of the contralateral sides in the 4, 6, and 8-week groups. The percentage of intermediary fibers was decreased in the bilateral sides in the 6 and 8-week groups (P<0.05). The percentage of light fibers was reduced in the ipsilateral sides in the 8-week group, whereas no alteration was observed in contralateral sides (P>0.05). In the ipsilateral sides, p-AMPK (Thr172)/AMPKα1 levels were increased in the 2 and 4-week groups (P<0.05), whereas no change was observed in the contralateral sides in either group (P>0.05).ConclusionUnilateral chew ing increases the oxidative metabolic ability in bilateral masseter muscle fibers especially in the non-working side accompanied with change of muscle fiber types. Theimprovement of aerobic metabolism ability is related to the AMPK signal pathway.

nicotine adenine dinucleotide tetrazolium reductase; adenosine monophosphate activated protein kinase; oxidative metabolism; unilateral chew ing

Q 257

A

10.7518/hxkq.2017.03.006

2016-06-22；

2017-03-10

暨南大学优秀人才基金（51025036）

石安迪，住院医师，硕士，E-mail：505256764@qq.com

刘静，教授，硕士，E-mail：lxxjing98@sina.com