昆仑雪菊提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用研究*

舒 畅，范 强，杨丽霞，姜良恩，张邦能，康万荣，张延英，万生芳

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

·实验研究·

昆仑雪菊提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用研究*

舒 畅1，范 强1，杨丽霞2，姜良恩1，张邦能3，康万荣1，张延英1，万生芳1

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

目的：观察昆仑雪菊提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用。方法：将35只雄性STZ诱导的糖尿病Wistar大鼠随机分为模型对照组,昆仑雪菊提取物低、中、高剂量组,吡咯列酮组5组，每组7只；另选7只SPF级雄性Wistar大鼠为正常对照组。正常对照组和模型对照组灌服生理盐水，昆仑雪菊低、中、高剂量组分别按100，200，400 μg/(g·d)剂量灌胃，吡咯列酮组灌服吡咯列酮10 μg/(g·d),连续4周。实验室检测大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖及血脂水平，采用ELISA法检测大鼠胰岛素分泌水平(INS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI1)、单核细胞趋化因子1(MCP1)，HE染色胰腺组织并光镜下观察胰岛结构。结果：昆仑雪菊提取物对降低糖尿病大鼠体质量作用不明显(P>0.05)，但对空腹血糖、餐后2 h 血糖具有降低作用，并在一定程度上能够促进胰岛素分泌，下调炎症因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6的表达，与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示各药物组具有保护胰岛β细胞、延缓胰岛衰竭的作用。结论：昆仑雪菊提取物在一定程度上具有降低2型糖尿病大鼠血糖、促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗的作用,其作用机制可能与下调炎症因子表达有关。

昆仑雪菊提取物/药效学；STZ；糖尿病大鼠模型；血糖；胰岛素抵抗；动物；大鼠

昆仑雪菊，民间又称“血菊”，植物学名是蛇目菊、金鸡菊(Coreopsis)，菊科金鸡属，一年生草本植物的干燥头状花序。它主要分布在我国新疆和田地区海拔高3 000米左右的昆仑山区，因此而得名昆仑雪菊，是一种与雪莲齐名，具有独特功效的稀有野生高寒植物，具有相当高的药用价值，被当地居民作为花茶饮用，被当地医院作为一种维药材使用，具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾的功效，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疔肿毒，是一种具有广阔的市场前景和研究价值的新品种药材[1]。临床上，雪菊花及复方制剂可用于预防、治疗呼吸系统、泌尿生殖系统何皮肤等的感染性疾病，以及高血压、高血脂症等[2]。目前有研究表明，昆仑雪菊中总黄酮含量显著高于市售菊花，且酚类化合物单体组成更加丰富，含量亦相对较高，具有较高的研究和开发价值[3-4]。近年来，市场上将雪菊主要作为降低血糖、血压、血脂的保健品进行销售。为了明确其药理作用，本课题采用STZ诱导的糖尿病大鼠模型，通过观察昆仑雪菊提取物对糖尿病大鼠血糖、血脂、血清炎症因子和胰岛素抵抗的作用，阐明其对糖尿病的作用及药理机制，旨在为糖尿病的治疗提供一种新方法。

1 材料与方法

1.1 动 物

70只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，购于甘肃中医药大学，许可证号：SCXK(甘)2004-0006。饲养于甘肃中医药大学屏障级动物实验室，每天自由饮水、摄食。

1.2 药品、试剂与仪器

昆仑雪菊，产地青海，购于青海优润堂商贸有限责任公司，由上海友思生物技术有限公司提取；盐酸吡格列酮片，北京太洋药业有限公司产品，批号130605。链脲佐菌素(STZ)，Sigma公司产品，批号046K1206。ELISA试剂盒：胰岛素(INS，批号CSB-E05070r)、MCP-1(批号CSB-E07429r)、PAI1(批号CSB-E07948r)、ICAM1(批号CSB-E04576r)，均为CUSABIO公司产品；TNF-α(批号DKW12-3720-096)、IL-1(批号DKW12-3012-048/DKW12-3012-096)、IL-6(批号DKW12-3036-096)，均为达科为生物技术有限公司产品；罗氏活力型血糖试纸，德国Roche Diagnostics GmbH公司产品。Accu-Chek Active [Model GC]血糖仪，德国Roche Diagnostics GmbH公司产品；2700型全自动生化仪，日本奥林巴斯公司产品；Bio-rad 680型酶标仪，美国伯乐公司产品。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立与给药

大鼠适应性饲养1周后，除正常对照组7只外，其余大鼠均给予高糖高脂饲料喂养，8周末尾静脉注射STZ 25 μg/(g·d)，l周后尾静脉取血测定血糖。随机血糖稳定>13.9 mmol/L者诊断为2型糖尿病，未成功模型追加25 μg/(g·d) STZ 1次。选取造模成功的大鼠35只，随机分为模型对照组，昆仑雪菊提取物低、中、高剂量组，吡格列酮组5组，每组7只。正常对照组和模型对照组灌服生理盐水，昆仑雪菊提取低、中、高剂量组分别按100，200，400 μg/(g·d)的剂量灌胃，吡咯列酮组灌服10 μg/(g·d)剂量的吡咯列酮。灌胃量为10 μL/g，所有药品以生理盐水配成所需的质量分数，1 d 1次，连续4周。

1.4 检测指标

4周后，禁食8 h，称量体质量，麻醉后，一次性心脏采血，颈椎脱位处死后，取胰腺组织。血液静置2 h，4 ℃、3 500 r/min离心20 min，取血清，-20 ℃保存；胰腺组织以40 g/L 甲醛固定，常温保存。

1.4.1 大鼠一般情况、血糖、血脂

观察大鼠精神状态、活动状况、毛色等一般情况，并称量体质量，测空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(P2hPG)和血清总胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

1.4.2 大鼠血清INS水平及炎症因子ICAMI、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-1、IL-6

根据试剂盒说明书进行，检测前先对所有样本进行低温离心，在反应孔中加标准品或待测标本，每孔剂量为100 μL。在空白对照孔中加入稀释液，剂量为100 mL；在37 ℃电热培养箱中进行孵育，孵育后对检测板进行洗涤；加酶标抗体进行酶联免疫反应。反应终止后，将检测板在酶标仪上进行检测，以空白对照孔调零，检测条件为450 nm，测定各孔OD值。

1.4.3 胰腺组织形态

HE染色，光镜下观察胰岛形态结构。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况对比

正常对照组大鼠皮毛光泽，精神状态良好，动作反应灵敏，行为活跃。模型对照组大鼠皮毛干枯无光泽，精神状态较差，动作迟缓，反应较慢，活动度差，并随着饲养时间程度加重。昆仑雪菊提取物各剂量组和吡格列酮组与模型对照组对比，上述情况有不同程度的改善。

2.2 各组大鼠体质量、血清FPG、P2hPG、INS水平对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠的体质量降低，FPG与P2hPG升高，INS水平降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，昆仑雪菊各剂量组大鼠体质量变化不明显，但FPG与P2hPG有不同程度的降低，其中高剂量作用显著，并且能显著促进胰岛素的分泌，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组 别剂量/(μg·g-1)体质量/gFPG/(mmol·L-1)P2hPG/(mmol·L-1)INS/(μIU·L-1)正常对照组—432.1±43.14.30±0.206.05±0.4390.03±18.72模型对照组—220.0±28.5*26.20±3.80*30.90±1.60*19.41±19.36*吡咯列酮组10231.4±41.025.45±7.3323.95±3.19#43.44±57.10#昆仑雪菊低剂量组100239.4±51.618.34±7.1127.74±3.8235.30±35.70#昆仑雪菊中剂量组200244.4±37.416.73±4.97#25.93±4.2439.37±42.38#昆仑雪菊高剂量组400238.3±32.016.91±7.33#23.65±6.77#42.53±49.67#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.3 各组大鼠血清CHOL、TG、HDL、LDL水平对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠CHOL、TG升高，差别有统计学意义(P<0.05)。昆仑雪菊提取物低、中、高剂量及吡咯列酮组的 CHOL、TG较模型对照组有一定下降趋势，HDL、LDL较之变化不大。表明：昆仑雪菊提取物对糖尿病大鼠血脂指标作用不明显。见表2。

组 别剂量/(μg·g-1)CHOL/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)正常对照组—1.51±0.230.88±0.240.96±0.170.27±0.02模型对照组—2.08±0.17*1.48±0.63*1.34±0.060.36±0.09吡咯列酮组101.84±0.371.20±0.661.25±0.200.28±0.13昆仑雪菊低剂量组1001.84±0.500.77±0.351.31±0.390.28±0.07昆仑雪菊中剂量组2001.81±0.33#0.71±0.63#1.22±0.270.35±0.19昆仑雪菊高剂量组4001.65±0.26#0.62±0.31#1.16±0.200.32±0.06

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.4 各组大鼠血清炎症因子ICAM1、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-1、IL-6对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清ICAMI、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-6水平升高，差别有统计学意义(P<0.05)；IL-1升高不明显，差别无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组对比，4个药物组炎症因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6水平下降，差别有统计学意义(P<0.05)，而TNF-α、IL-1水平较之差别无统计学意义(P>0.05)。结果表明：昆仑雪菊提取物对糖尿病大鼠血清炎症因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6在一定程度上具有抑制作用。见表3。

组 别剂量/(μg·g-1)ICAM1/(μg·L-1)PAI1/(μg·L-1)MCP1/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)IL-1/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)正常对照组—99.39±5.310.33±0.8588.82±23.68104.4±10.8444.19±1.6765.43±5.61模型对照组—173.6±202.4*8.84±8.95*172.0±78.84*131.9±44.1346.54±2.73120.3±102.1*吡咯列酮组1096.80±10.49#3.85±1.55#111.3±26.25#109.2±14.9051.67±14.183.58±44.59#昆仑雪菊低剂量组10095.12±7.83#3.31±2.75#111.85±36.5#129.1±41.5144.19±2.8168.92±20.16#昆仑雪菊中剂量组20092.84±5.19#3.87±3.11#90.81±30.96#124.6±13.5644.59±1.0796.47±33.08#昆仑雪菊高剂量组40093.70±4.55#4.73±5.74#88.65±22.39#136.3±41.5045.09±1.3487.99±20.30#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.5 各组大鼠胰腺组织形态对比

正常对照组大鼠胰岛边界清楚，结构完整，外部形态丰满，胰岛细胞分布均匀，各细胞核呈椭圆形，胞浆丰富，胰岛数量及岛内细胞数均较多。模型对照组大鼠胰岛数量减少，体积变小，边界不清，胰岛细胞胞浆减少，细胞核固缩。各药物组均有不同程度的改善。见图1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡咯列酮组；D.昆仑雪菊低剂量组；E.昆仑雪菊中剂量组；F.昆仑雪菊高剂量组

3 讨 论

糖尿病的发病因素很多，发病机制复杂，目前大量研究表明胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病的发病基础。IR是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素的敏感性下降，产生的生物学效应低于正常状态，胰岛素的作用没有很好地发挥出来。IR与很多代谢性疾病如高血压、高血脂、糖尿病、痛风等有关，是这些疾病的共同病理生理基础。因此，研究改善胰岛素抵抗对于预防糖尿病等许多慢性代谢性疾病意义重大。

目前，现代医学在治疗胰岛素抵抗方面存在着许多瓶颈问题尚未解决，其中患者不能长期耐受药物的副作用是最常见的问题，此外还有药物的不良反应及长期服用所产生的耐药性等等；因此，纯天然植物药物的开发和应用具有很大的优势和广阔的市场前景。许多纯天然植物中含有黄酮类化合物，其中许多是药食两用植物。在国外，很多食品添加剂或营养补充剂就是黄酮类化合物，黄酮类化合物与化学药物相比具有较高的安全性，适合患者长期服用。大量研究表明，植物黄酮类化合物在改善胰岛素抵抗方面具有显著疗效，已研究发现有荞麦花叶总黄酮、玉米须总黄酮、葛根黄酮等黄酮苷药物具有降血糖、改善胰岛素抵抗的功效，有些已用于临床[6-8]。因此，将黄酮类化合物开发成为改善胰岛素抵抗、治疗糖尿病的药物，具有良好的应用前景。昆仑雪菊是纯天然野生植物中含黄酮类化合物较高的植物，昆仑雪菊中水溶性总黄酮含量平均为18.62%[1]，水溶性总黄酮主要包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮及异黄铜类化合物[9]；醇溶性总黄酮含量为12.28%[10]，无查耳酮类化合物。研究发现，雪菊提取物内大量的黄酮类化合物具有抗氧化、扩张冠状动脉-抗心肌缺血、降血压、抑制艾滋病毒、抗癌等生物活性和药理作用[9]。近年来虽然开展了一些有关昆仑雪菊化学成分的研究，但其药理作用研究仍然不足，很多研究尚处于初级阶段，生物活性物质基础尚未明确，使其临床应用受到限制，这对于我国中药材资源的开发十分不利；因此，非常有必要加快对该药材的药用价值研究，并阐明其化学成分和药理活性，以便于开发出疗效确切、稳定的新药。

本研究结果显示：昆仑雪菊提取物对降低糖尿病大鼠体质量作用不明显；与模型对照组相比，在灌胃4周后，对糖尿病大鼠的空腹血糖、餐后2 h血糖有降低作用；均具有促进胰岛素分泌，增强胰岛素敏感性的作用；对糖尿病大鼠血清炎症因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6降低作用明显，对TNF-α、IL-1具有降低趋势，但无统计学差异，说明昆仑雪菊提取物对糖尿病大鼠血清炎症因子在一定程度上具有抑制作用。HE染色结果显示：昆仑雪菊提取物具有保护胰岛β细胞、延缓胰岛功能衰竭的作用。结果表明：昆仑雪菊提取物在一定程度上具有降低糖尿病大鼠血糖、改善胰岛素抵抗的作用，但由于药物的纯度较低，灌胃的时间较短，药效发挥并非理想，这需要在以后的研究中进一步改善。本研究仅限于动物实验，缺乏作用机制及临床的深入研究，这将成为本课题以后的研究重点，以期能够为糖尿病的治疗提供更为有效的药物。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2017)03-0066-05

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.03.31

舒畅(1978-)，女(汉族)，重庆人，副教授，硕士,主要从事中医药防治糖尿病的研究。

杨丽霞，副主任医师，博士,13038770310@163.com

国家自然科学基金(81202971)；甘肃省自然科学基金项目(编号1308RJZA106)；兰州市科技局项目(2014-1-20)

2016-08-15；

2017-01-17