羧胺三唑联合地塞米松有效缓解小鼠过敏性气道炎症

孙芳蕊，陈晨，石婧，鞠瑞，朱蕾，李娟，叶菜英，郭磊

羧胺三唑联合地塞米松有效缓解小鼠过敏性气道炎症

孙芳蕊，陈晨，石婧，鞠瑞，朱蕾，李娟，叶菜英，郭磊

目的评价羧胺三唑（CAI）联合地塞米松对小鼠过敏性气道炎症的治疗效果，为哮喘性疾病探索安全、有效的联合用药方案。

方法将小鼠分为对照组、模型组、40 mg/kg CAI 治疗组（CAI40）、低剂量地塞米松治疗组（DL）、高剂量地塞米松治疗组（DH）、低剂量地塞米松联合 20 mg/kg CAI 治疗组（DL20）、低剂量地塞米松联合 40 mg/kg CAI 治疗组（DL40）。建立过敏性哮喘模型，取肺泡灌洗液（BALF），ELISA 法检测其中 IL-4、IL-13、IFN-γ 水平；计 BALF 中总细胞数和嗜酸性粒细胞数；ELISA 法检测血清中 IgE 水平；取左肺切片，HE 染色后观察肺组织病理水平改变。

结果与对照组相比，模型组小鼠呈现出明显的气道炎症反应，包括 BALF 中 IL-4、IL-13 水平及炎性细胞数明显升高，而 IFN-γ 水平显著降低，血清中 IgE 水平显著升高，肺组织病理切片的 HE 染色结果呈现出明显的炎症细胞聚集浸润。与模型组相比，各治疗组均有缓解炎症的效果。联合用药组小鼠的 BALF 中 IL-4、IL-13 水平及炎性细胞数均低于 CAI40 组和 DL 组，而 IFN-γ 水平高于三个单药治疗组。联合用药组血清中 IgE 水平均低于三个单药治疗组。肺组织病理结果显示，联合用药组的肺组织炎症细胞浸润、杯状细胞增生、气道平滑肌增厚等气道重塑程度均低于CAI40 组和 DL 组，与 DH 组相当。

结论低剂量地塞米松联合低、高剂量羧胺三唑对卵清蛋白诱导的小鼠过敏性气道炎症有良好的治疗效果，比单药治疗组表现出更强的抗炎作用。因此，适当降低地塞米松剂量，通过联合羧胺三唑来治疗过敏性气道炎症，减少地塞米松耐药性和依赖性等不良反应，或可成为治疗过敏性气道炎的一种新方法。

羧胺三唑； 地塞米松； 哮喘； 气道炎症

哮喘是一种慢性气道炎症，涉及多种炎性细胞和炎症介质。近年来随着环境污染加重，哮喘的发病率呈现上升的趋势。糖皮质激素是目前治疗该疾病的最有效药物，但少数患者对糖皮质激素存在抵抗，治疗效果不理想，且长时间使用糖皮质激素还会产生一定的耐药性及药物依赖性。因此，我们亟需寻找有效的替代方法来预防和治疗这种慢性气道炎性疾病[1-2]。

羧胺三唑（carboxyamidotriazole，CAI）是一种非细胞毒类抗肿瘤药物，近年来发现 CAI 通过非选择性抑制各亚型 PDEs，抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性细胞因子的产生，从而发挥抗炎作用。因此，考虑将 CAI 与地塞米松联合应用，评价药物对炎症的治疗作用，同时缓解地塞米松的耐药性及依赖性[3-4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 56 只 SPF 级 C57BL/6 雌性小鼠，6 ～ 8 周，体重 18 ～ 22 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验前一周适应性饲养于动物房，自由饮水摄食，环境温度 25 ℃，湿度 40%～ 60%，每日 12 h 光照。

1.1.2 实验分组 动物随机分为 7 组，每组8 只，分别为对照组（CON）、模型组（PEG）、40 mg/kg CAI 治疗组（CAI40）、低剂量地塞米松（0.25 mg/kg）治疗组（DL）、高剂量地塞米松（0.5 mg/kg）治疗组（DH）、低剂量地塞米松（0.25 mg/kg）联合 20 mg/kg CAI 治疗组（DL20）、低剂量地塞米松（0.25 mg/kg）联合 40 mg/kg CAI治疗组（DL40）。

1.1.3 药物及试剂 羧胺三唑由中国医学科学院药物研究所合成。地塞米松磷酸钠注射液购自北京协和医院，产自广州白云山天心制药股份有限公司，规格：1 ml∶5 mg。卵清蛋白（OVA，grade V）购自美国 Sigma-Aldrich 公司；铝佐剂（2%）购自美国 InvivoGen 公司；IL-4、IL-13、IFN-γ ELISA 试剂盒和 IgE ELISA 试剂盒购自达科为生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型建立及药物治疗 除对照组小鼠外，每组小鼠第 0、14 天腹腔注射 20 μg OVA 和200 μl 免疫佐剂致敏，对照组小鼠腹腔注射 200 μl生理盐水。第 21 ～ 26 天除对照组，每组小鼠雾化吸入 5% OVA 激发，对照组小鼠雾化吸入生理盐水，每天持续激发 1 h[5-7]。激发前 0.5 h，模型组小鼠灌胃 PEG400（CAI 溶剂），给药组小鼠根据对应组别给药。对照组小鼠激发前 0.5 h 腹腔注射200 μl 生理盐水（图 1）。

1.2.2 BALF 中 IL-4、IL-13、IFN-γ 检测及细胞计数 末次激发 24 h 后小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，暴露气管，注射器取 0.5 ml PBS 灌洗肺泡，反复 3 次，共得 1.5 ml 肺泡灌洗液（BALF）。BALF 于 4 ℃、2500 r/min 离心 10 min，收集上清，用于检测 IL-4、IL-13、IFN-γ 含量，具体步骤根据 ELISA 试剂盒说明书进行。BALF 沉淀用1 ml PBS 重悬，计总细胞数。取 200 μl 细胞悬液涂片，晾干固定后，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下做细胞分类，计 200 个细胞中嗜酸性粒细胞个数。

1.2.3 血清中总 IgE 检测 末次激发 24 h 后小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，开胸腔暴露心肺，心脏取血，血液于 4 ℃、3000 r/min 离心 25 min，收集血清。血清用于检测 IgE 含量，具体步骤根据ELISA 试剂盒说明书进行。

1.2.4 肺组织病理切片及染色 末次激发 24 h后小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，开胸腔暴露心肺，取肺组织浸泡于 4% 多聚甲醛中固定。常规脱水，石蜡包埋，切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察炎症细胞浸润和气道重塑情况。

1.3 统计学处理

实验数据用 SPSS19.0 软件分析，GraphPad Prism5 作图，数据用表示，组间比较使用单因素方差分析，P ＜ 0.05 时表示差异有统计学意义。

图 1 OVA 诱导小鼠过敏性哮喘模型建立Figure 1 The mice model of asthma induced by ovalbumin

2 结果

2.1 BALF 中 IL-4、IL-13、IFN-γ 水平

与对照组相比，模型组小鼠 IL-4、IL-13 显著增加（P ＜ 0.001）、IFN-γ 水平显著降低（P ＜ 0.001）；与模型组小鼠相比，DL 组及 DH 组的 IL-4 水平明显下调（P ＜ 0.01），CAI40 组的 IL-4 水平有所下调（P ＜ 0.05），DL20 组小鼠的 IL-4 水平显著下调（P ＜ 0.001），且比单独使用高剂量地塞米松组小鼠的 IL-4 水平下调明显，效果好于 DL40 组；DL40 组小鼠的 IL-4 水平明显下调（P ＜ 0.01），比 CAI40 组小鼠和 DL 组小鼠下调显著，与高剂量地塞米松组作用相当（图 2A）。BALF 中 IL-13水平各治疗组均比模型组明显下调（P ＜ 0.001），且联合用药组的下调作用强于 CAI40 组和 DL 组（图 2B）。BALF 中 IFN-γ 水平在 CAI40 组和DL40 组均明显上升（P ＜ 0.01），DH 组和 DL20组小鼠 BALF 中 IFN-γ 水平均有所上升（P ＜0.05），而 DL 组小鼠 BALF 中 IFN-γ 水平无明显变化（P ＞ 0.05），联合用药组小鼠 BALF 中IFN-γ 水平均比单独使用地塞米松上调效果明显，且 DL40 组作用效果最佳（图 2C）。各治疗组均能有效缓解 Th2 细胞与 Th1 细胞的功能失衡，且DL20 组的缓解效果强于 CAI40 组、DL 组及 DH组（图 2D）。

2.2 BALF 中细胞种类分析

与对照组相比，模型组小鼠的总细胞数和嗜酸性粒细胞数均明显增加（P ＜ 0.001）。与模型组相比，各治疗组 BALF 中细胞总数均明显下降（P ＜0.001），两个联合用药组降低 BALF 中细胞总数的作用均比单独使用 CAI40 组和 DL 组明显，与DH 组水平相当（图 3A）。各治疗组小鼠 BALF 中的嗜酸性粒细胞数均显著下降（P ＜ 0.001），而DL20 组和 DL40 组嗜酸性粒细胞降低水平均比CAI40 组和 DL 组明显，且 DL40 组效果优于DH 单药治疗组（图 3A）。

2.3 血清中 IgE 水平

与对照组相比，模型组小鼠血清中 IgE 水平明显增加（P ＜ 0.001）；CAI40 组、DL 组、DH 组小鼠血清中 IgE 水平较模型组小鼠明显下调（P ＜0.05）；DL20 组小鼠血清中 IgE 水平较模型组小鼠显著下调（P ＜ 0.01），DL40 组小鼠血清中 IgE水平较模型组小鼠显著下调（P ＜ 0.001），两联合用药组小鼠血清中 IgE 水平均低于 CAI40 组、DL组及 DH 组，其中 DL40 组小鼠血清中 IgE 水平下调最为明显（图 4）。

图 2 ELISA 检测各组小鼠肺泡灌洗液中 IL-4（A）、IL-13（B）、INF-γ 含量（C）以及 Th2 细胞与 Th1 细胞（IL-4 与 INF-γ）功能失衡比（D）（#与对照组比较，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；*与模型组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 2 The levels of IL-4 (A)、IL-13 (B)、INF-γ (C) and the unbalance of Th2 cytokines and Th1 cytokines (D) (#P ＜ 0.01,###P ＜0.001 compared with control group;*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 compared with model group)

图 3 各组小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞总数（A）和嗜酸性粒细胞数（B）（#与对照组比较，###P ＜ 0.001；*与模型组比较，***P ＜ 0.001）Figure 3 The count of total inflammatory cell (A) and eosinophils (B) in BALF (###P ＜ 0.001 compared with control group;***P ＜0.001 compared with model group)

2.4 肺组织病理形态观察

在 100 倍光学显微镜下可看到，正常组小鼠支气管周围无明显炎性细胞浸润，气道结构及管壁正常；模型组小鼠的支气管壁上皮明显增厚、脱落，支气管平滑肌增厚，杯状细胞增生明显，气道周围可见大量嗜酸性粒细胞及巨噬细胞聚集浸润；各给药组小鼠的炎症程度均有所缓解，两个联合用药组小鼠抑制炎症细胞浸润的作用强于 DL 组和CAI40 组，DL40 组抑制炎症细胞浸润程度效果与DH 组相当。两个联合用药组小鼠均未见明显的气道上皮及平滑肌增厚，亦未见明显杯状细胞增生，对气道重塑的抑制作用均强于 DL 组、DH 组及CAI40 组（图 5）。

图 4 ELISA 检测各组小鼠血清中 IgE 含量（#与对照组比较，###P ＜ 0.001；*与模型组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P＜ 0.001）Figure 4 The level of IgE in serum measured by ELISA (###P＜ 0.001 compared with control group;*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 compared with model group)

图 5 HE 染色观察各组小鼠肺组织病理切片中炎症细胞浸润程度（× 100）Figure 5 The recruitment of infiltrated inflammatory cell in lung tissue stained with HE (× 100)

3 讨论

过敏性哮喘是由 IgE 介导的 I 型超敏反应，过敏源进入人体后，激活 Th2 细胞和 B 细胞，诱导产生特异性 IgE，使机体处于致敏状态。当机体患病严重时，体内 IgE 水平明显升高。因此降低IgE 水平成为评价过敏性哮喘治疗效果的重要指标。在哮喘的发病机制中，Th2 细胞的异常活化起到至关重要的作用[8]，Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-13、IL-5 等细胞因子，与体内 IgE 分泌增加、嗜酸性粒细胞大量分化聚集有关[9-10]；Th1 细胞在哮喘疾病中主要表现为抑制效果，主要分泌细胞因子 IFN-γ，故 Th1 细胞与 Th2 细胞的异常失衡是衡量哮喘疾病严重程度的重要指标[11]。哮喘的主要表现为肺组织内大量炎症细胞聚集，气道重塑，炎症细胞因子分泌增加，IgE 含量升高等[9]。

糖皮质激素类药物是一种经典的治疗哮喘的药物，吸入糖皮质激素类药物可以有效地抑制哮喘气道炎性程度，但此类药物有严重的不良反应，长期使用会导致机体产生耐药性、依赖性，甚至会导致老人和儿童骨质疏松等。寻找有效、安全的替代药物已成为近几年治疗哮喘疾病领域的热点。

羧胺三唑是一种非细胞毒类的药物，早期用于抑制肿瘤细胞增殖，近期有实验表明其在抗炎方面表现出良好的效果[4]。同时也已证实 CAI 是非选择性的 PDE 抑制剂[3]，对各种不同亚型 PDEs 均有抑制作用。此外，羧胺三唑的不良反应少且轻微，主要表现为胃肠道反应，药物安全性较好。因此考虑将 CAI 与糖皮质激素类药物地塞米松合用，在达到治疗效果的同时，减少地塞米松用量，减轻其耐药性等不良反应。

本次研究中，我们发现将低剂量地塞米松分别与 20 和 40 mg/kg CAI 合用，均表现出显著的抗炎效果，作用强于 DL 组和 CAI40 组。在缓解Th2 型细胞异常活化方面，DL20 组抑制 IL-4、IL-13的作用与使用高剂量地塞米松组（DH 组）效果相当；在活化 Th1 细胞方面，DL40 组的作用优于 DH 组；在调节 Th2 细胞与 Th1 细胞功能失衡方面，DL20 组的效果最佳。在抑制肺泡炎症细胞和嗜酸性粒细胞方面，DL40 组的抑制效果强于 DH 组。同时，DL20 组和 DL40 组均表现出良好的抑制 IgE 产生的效果，其作用均强于 DH组。通过肺组织病理切片中发现，DL20 组和 DL40组缓解肺部炎症细胞浸润、聚集，抑制气道重塑的作用强于 DL 组和 CAI40 组，作用效果与 DH组相当。

综上所述，本研究证实了将低剂量地塞米松分别与 20 和 40 mg/kg CAI 合用，不仅减少了糖皮质激素类药物的用量，又达到了与高剂量地塞米松相当的作用效果。在达到抗炎效果的同时，有望克服长期大量使用糖皮质激素类药物所产生的耐药性问题和其他严重不良反应，为有效地治疗哮喘等慢性气道炎性疾病提供新型的药物组合。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):242-247

小牛血类产品原料质量管理检查手册研讨会在京召开

4 月 21 日，我会在京召开小牛血类产品原料质量管理检查手册研讨会，李少丽副理事长出席会议。《小牛血类产品原料质量管理检查手册》起草小组向与会代表介绍规范起草的过程，在起草过程中参考了 GMP 和其他相关规定，与专家和业内企业进行交流，形成了本次讨论的草稿。

会上，中国食品药品检定研究院沈琦所长、董关木研究员、李秀华副研究员结合协会新生牛血清达标检查工作和 GMP工作的经验，对小牛血类产品原料质量管理检查的主体、项目、程度提出了建议，并明确协会行业自律工作和 GMP 检查的不同。会议逐条对检查手册的具体条款进行讨论，参会代表就实际生产过程中的问题和专家进行交流，专家根据 GMP 生化药品附录的规定对企业提出建议，强调小牛血类产品原料质量管理检查针对企业是否对原料采集单位进行了质量延伸管理，并细化相关要求。经过讨论，与会代表一致认为修改后的达标检查手册的条款对企业具有指导意义。会议要求检查手册起草小组根据会议意见，修改手册后并再征求意见。

食药总局发布仿制药质量和疗效一致性评价品种分类指导意见为规范仿制药质量和疗效一致性评价工作，国家食品药品监督管理总局组织制定了《仿制药质量和疗效一致性评价品种分类指导意见》。详情请登录国家食品药品监督管理总局网站 http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/171385.html 查阅。

Inhibitory effects of combined carboxyamidotriazole with dexamethasone in allergic airway inflammation

SUN Fang-rui, CHEN Chen, SHI Jing, JU Rui, ZHU Lei, LI Juan, YE Cai-ying, GUO Lei

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effects of combined carboxyamidotriazole (CAI) with dexamethasone (DEX) in allergic airway inflammation.

MethodsThe allergic asthma model was established by ovalbumin (OVA) sensitization and challenge in mice, which were divided into the following groups: control group (CON), model group (PEG), 40 mg/kg CAI-treated group (CAI40), low-dose DEX-treated group (DL), high-dose DEX-treated group (DH), the combination of 20 mg/kg CAI with low-dose DEX treated group (DL20), the combination of 40 mg/kg CAI with low-dose DEX treated group (DL40). The levels of IL-4, IL-13, IFN-γ in bronchoalveolar lavage (BALF) and the content of IgE in serum were measured by ELISA. Cell counting was conducted to quantify the total inflammatory cells number and eosinophils number in BALF. Lung tissues were cut into slices and stained with HE for evaluation of recruitment of infiltrated inflammatory cells.

ResultsThe model group presented severe airway inflammatory responses compared with control group. All treatment strategies effectively inhibited airway inflammatory responses. Lower levels of IL-4, IL-13 or IgE were observed in DL20 group compared with CAI40 group and DL group. In DL40 group, the IgE level in serum was significantly lower than that of DH group, and the total inflammatory cells number and eosinophils number in BALF of DL40 group were significantly less than that in DH group. Both combination groups showed milder recruitment of inflammatory cells in lung tissues compared with CAI40 group and DL group.

ConclusionThe airway inflammatory responses are effectively inhibited in all the treatment groups. Furthermore, better effects are seen in both combination groups than in 40 mg/kg CAI-treated group and low-dose DEX-treated group. This study may provide a new way to treat allergic airway inflammation by the combination of carboxyamidotriazole with dexamethasone, with the potential ofreducing adverse reactions of glucocorticoids.

Carboxyamidotriazole; Dexamethasone; Asthma; Allergic airway inflammation

GUO Lei, Email: guoleistu@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.009

国家自然科学基金（81402923）；北京协和医学院 2015 协同创新基金（3332015168）；“十二五”国家科技重大专项（2014ZX 09507003-003）；2016重大协同创新项目（2016-I2M-1-011）

100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所

郭磊，Email：guoleistu@sina.com

2017-02-04

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(3):242-247

Author Affiliation: Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China