一种糖类抗原242全自动管式化学发光定量免疫检测试剂的建立

杨红宾，刘江武，翁祖星，黄刘女，徐飞海，孙旭东

一种糖类抗原242全自动管式化学发光定量免疫检测试剂的建立

杨红宾，刘江武，翁祖星，黄刘女，徐飞海，孙旭东

目的建立一种全自动测定血清糖类抗原 242（CA242）的管式化学发光定量免疫检测试剂。

方法采用均相磁微粒标记技术与高灵敏的吖啶酯化学发光技术，依据双抗体夹心原理，以 4 株单克隆抗体为原料进行配对单抗筛选，从而建立 CA242 化学发光磁微粒测定试剂，并在全自动管式化学发光仪上对其灵敏度、精密度、回收率与相关性等进行初步评价。

结果筛选的最优单抗配对 7C10（包被）-3H1（标记）的反应活性最高，且 CA19-9 和 CA50 对 CA242检测的干扰很小。该试剂的分析灵敏度为 0.69 U/ml，高浓度样本精密度为 3.0%，低浓度样本精密度为 5.7%，回收率为101.5%。与当前主流的商品化试剂的定量相关性良好（y = 1.027x – 0.2991，r = 0.9911，P ＜ 0.05）。

结论利用抗 CA242 单抗为原料建立 CA242 全自动管式化学发光定量免疫检测试剂，该试剂性能良好，所有检测操作均由仪器自动完成，可满足目前临床医学的高通量检测需求。

糖类抗原 242； 双抗体夹心法； 化学发光

胰腺癌是人类死亡率最高的恶性肿瘤之一，根据资料显示，胰腺癌 5 年生存率仅为 5%，是目前临床诊治最为困难的实体肿瘤[1]。因此，对胰腺癌的早期发现、早期诊断及早期治疗被认为是改善患者预后的唯一途径。CA19-9 是目前临床证实并广泛应用的胰腺癌标志物[2]，但在其他胃肠道恶性肿瘤（如胆囊癌）以及慢性胰腺炎、肝炎、胆道梗阻等良性疾病中 CA19-9 也升高[3]，而 CA242 水平却很少或轻微升高。目前普遍认为，CA242 在胰腺癌的鉴别诊断中有着更高的特异性[4]。有研究表明，将 CA242 与 CA19-9 联合诊断胰腺癌，灵敏度虽无明显提高（68.5% ～ 78.1%），特异度却显著增加（90.4% ～ 96.6%）[5]。

CA242 是一种唾液酸化的黏蛋白型糖链抗原，先由 Colo205 单克隆抗体免疫小鼠得到系列抗体，再经单克隆抗体筛选得到 CA242，它的抗原决定簇为糖链结构，出现于黏蛋白表面[6-7]。CA242 与CA19-9、CA50 一样都是 Lewis a 血型上的抗原决定簇，但 CA242 的抗原决定簇与 CA19-9 和CA50 不同，它不能与唾液酸化的半乳糖苷反应[8]。健康者血清 CA242 含量小于 20 U/ml[9]，临床上在不同良恶性疾病时，CA242、CA19-9 和 CA50的抗原决定簇出现的机会和程度并不相同。恶性肿瘤发生时，三种抗原决定簇的出现均较正常时明显增多[10]，但 CA242 对恶性肿瘤的诊断比 CA19-9和 CA50 更加特异[11]。因此糖类抗原 CA242 作为一种较晚发现的肿瘤标志物，具有较优诊断价值。目前国内 CA242 检测试剂质量参差不齐，临床上广泛使用的是瑞典 CanAg 公司生产的酶联免疫吸附分析法（ELISA）CA242 检测试剂[12]，但由于是半定量、自动化程度低，操作繁重且耗时较长（4 h）的分析方法，不能很好地满足临床需要。为此，我们利用国产 CARIS200 全自动化学发光免疫分析仪和磁微粒子技术结合超敏感的吖啶酯化学发光体系[13]，进行全自动化、高通量、操作简单方便的 CA242 管式化学发光磁微粒法（CMIA）试剂的研制。

1 材料与方法

1.1 样本与材料

1.1.1 临床样本与 CA242 校准品 206 例临床血清样本均由厦门大学提供，包括胰腺癌患者血清样本 47 例，胰腺炎、胆道梗阻等良性疾病患者血清样本 90 例，以及 69 例健康体检者血清，均保存于 –20 ℃。浓度分别为 0.4、2、10、50、250、1250 U/ml 的 6 份 CA242 校准品由本公司进行配制。

1.1.2 主要试剂及耗材 磁微粒 EM1 100/40 为德国 Merck 公司的产品；ECD 为美国 Sigma 公司的产品；吖啶酯和发光激发液均由本公司提供；4 株 CA242 单抗（3H1、7B3、7C10、12F1）均由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心提供；各种常规化学试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器 CARIS 系列化学发光仪为厦门优迈科医学仪器有限公司的产品；Sunris2 酶标仪购自瑞士 Tecan 公司；CA242 ELISA 检测试剂盒（含标准品和质控品）为瑞典 CanAg 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 吖啶酯的标记 将吖啶酯加入抗体溶液中，混匀，避光孵育。以甘氨酸溶液终止反应，将得到的产物全部透析至 20 mmol/L 磷酸盐缓冲液pH 7.4 中，于 –20 ℃ 避光保存。

1.2.2 磁微粒包被抗体 取磁微粒用 EDC 溶液活化后，加入抗体进行分子偶联；再用含牛血清白蛋白的 20 mmol/L 磷酸盐缓冲液 pH7.4 进行封闭；将封闭后的磁微粒置于 2 ～ 8 ℃ 保存备用。

1.2.3 参比试剂盒的检测 按照 CA242 ELISA检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 CA242 管式化学发光磁微粒法 首先将标记后的吖啶酯稀释 200 倍，将包被后的磁微粒稀释 5 倍，均保存于 4 ℃ 备用。依据双抗体夹心法原理，检测步骤为：①加样：分别取 50 μl 检测样本（校准品和血清）和 50 μl 磁微粒于孵育杯内混匀，37 ℃ 孵育 10 min；②加入吖啶酯试剂：取50 μl 抗 CA242 抗体-吖啶酯标记物试剂，加入孵育杯内，37 ℃ 孵育 20 min；③洗涤：用专用洗涤液洗涤 2 遍；④发光：加入 50 μl 激发液，混匀；⑤读值：测定样本的相对发光强度，根据校准曲线，计算出样本中 CA242 的浓度。

图 1 单抗配对组合的筛选结果Figure 1 Screening of monoclonal antibody pairs

2 结果

2.1 单抗最优配对组合的获得

为了排除人血清中内源性 CA19-9 或 CA50的干扰，对阳性与阴性对照样本进行内源性 CA19-9或 CA50 确认。根据 CA242、CA19-9 和 CA50 的浓度挑选出三组样本作为 CA242 的阳性对照（CA242 为 113.35 U/ml、CA19-9 为 304.04 U/ml、CA50 为 74.73 U/ml）、假阳性对照（CA242 为3.91 U/ml、CA19-9 为 63.54 U/ml、CA50 为37.82 U/ml）、阴性对照（CA242 为 3.84 U/ml、CA19-9 为 13.17 U/ml、CA50 为 4.56 U/ml）。基于双抗体夹心法原理进行抗体配对筛选，将 4 株单抗（3H1、7B3、7C10、12F1）进行 12 组交叉配对组合，检测三份样本（阳性对照、假阳性对照、阴性对照），根据检测的相对发光强度（RLUs），筛选特异性强、信噪比好的抗体配对。结果（图 1）显示，7C10（包被）-3H1（标记）抗体组合的试剂阳性对照的反应活性最高，虽然阴性样本本底偏高，但假阳性对照与阴性对照的相对发光强度一致，表明该抗体配对检测 CA242 受 CA19-9 和CA50 的干扰小。

2.2 CA242 CMIA 方法的标准曲线绘制

采用 GraphPad Prism5.0 软件进行四参数（4PLC）拟合，以 CA242 校准品的浓度为 x 轴，检测的发光信号值为 y 轴，绘制剂量反应曲线（图 2），校准品浓度与信号强度呈良好相关性（r = 0.9999）。

图 2 CA242 CMIA 标准曲线Figure 2 CA242 CMIA calibration curve

2.3 分析灵敏度评价

重复测定 0 U/ml 样本 20 次，计算其平均相对发光强度（X）、标准差（SD），得出 X + 2SD，然后将 X + 2SD 的 RLUs 值带入标准曲线方程中，求出对应的分析灵敏度平均值为 0.69 U/ml。

2.4 精密度（CV）评价

重复测定 CA242 高、低浓度样本（约 100 U/ml与 10 U/ml）各 10 次，计算测定值的平均值和标准差（SD），按照公式 CV = SD/平均值 × 100%，计算精密度。本试剂的高浓度样本精密度为 3.0%，低浓度样本精密度为 5.7%。

2.5 回收率检测

将 CA242 高浓度标准血清按 1∶9 的比例加入 3 份正常人血清，测定回收率为 101.5%。

2.6 与 CanAg 公司的 CA242 ELISA 试剂的比较

将本试剂与 CanAg 公司的 ELISA 试剂平行检测 206 份临床样本，采用 GraphPad Prism5.0 软件进行相关性分析，结果显示两者相关系数 r 值为0.9911，斜率为 1.027，截距为 –0.2991（图 3），表明两者的定量相关性良好。

图 3 CMIA 法与 ELISA 法的血清 CA242 定量相关性Figure 3 The correlation of determination serum CA242 between CMIA and ELISA

3 讨论

由于 CA242 与 CA19-9、CA50 一样都是Lewis a 血型上的抗原决定簇[8]，可以捕获CA242的抗体，可能也可捕获 CA19-9 与 CA50。因此在双抗体夹心法检测 CA242 时，抗体配对的组合尤为关键，至少要保证其中一株抗体能够特异性地识别 CA242 的抗原决定簇。在 CanAg 公司的CA242 ELISA 法中，捕获抗体 MAb C242 特异性识别 Lewis a，测定抗体 MAb C242 特异性地与CA242 抗原决定簇结合。本研究在获得关键的4 株单克隆抗体原料后，将对 CA242 呈阳性的这4 株鼠单抗进行组合配对，为了最大程度的减小临床样本中内源性 CA19-9 与 CA50 的干扰，本研究设置了一组假阳性对照，排除了筛选出的捕获和测定抗体都仅特异性识别 Lewis a 的情况，因此，对于抗体配对筛选的准确性有明显的促进作用。目前 CA242 测定常用的方法有放射免疫分析法（RIA）、ELISA 和化学发光免疫分析法（CLIA）等。RIA 具有受外界因素影响较小，可直接测定、灵敏、高效的优点，可检测浓度达 0.08 U/ml。但它存在放射性污染、同位素衰变、半衰期短、标准曲线稳定性差、操作复杂、时间长、重复性欠佳等问题，临床已很少使用 RIA 分析 CA242。ELISA使用最为广泛，但该法的局限性明显，如：①手工操作，每个工作日一般只能进行一次检测；②操作步骤和影响因素较多。本研究采用的磁微粒标记工艺与吖啶酯标记工艺均经过了不断优化，确定了最佳的标记条件及标记浓度，在检测体系方面，本CMIA 法结合全自动仪器进行了各组分最佳工作浓度、孵育时间、洗涤次数等一些优化，从而保证了试剂与仪器较好的配套。本研究建立的 CA242全自动的 CMIA 分析法整个检测过程耗时约30 min，由于管式化学发光全自动化的优势，可保证每小时检测 200 个样本。本试剂检测 CA242 分析灵敏度可达到 0.69 U/ml，线性范围可达 3 个数量级，明显宽于 ELISA 法。与 CanAg 公司的ELISA 法进行定量相关性分析，结果表明本试剂测定血清 CA242 与市售试剂相关性好，且定量准确，可满足目前现代临床医学检测需求。

[1] Roy N, Malik S, Villanueva KE, et al. Brg1 promotes both tumor-suppressive and oncogenic activities at distinct stages of pancreatic cancer formation. Genes Dev, 2015, 29(6):658-671.

[2] Li FM. The significance of CEA, CA19-9 and CA242 in the diagnosis of pancreatic. J Radioimmunology, 2010, 23(4):448-449. (in Chinese)李凤妹. CEA、CA19-9及CA242 联检在胰腺癌诊断中的意义. 放射免疫学杂志, 2010, 23(4):448-449.

[3] Huang ZB, Zhou X, Xu J, et al. Prognostic value of preoperative serum tumor markers in gastric cancer. World J Clin Oncol, 2014, 5(2): 170-176.

[4] Kim J, Lee YS, Hwang IK, et al. Postoperative carcinoembryonic antigen as a complementary tumor marker of carbohydrate antigen 19-9 in pancreatic ductal adenocarcinoma. J Korean Med Sci, 2015, 30(3):259-263.

[5] Harsha HC, Kandasamy K, Ranganathan P, et al. A compendium of potential biomarkers of pancreatic cancer. PLoS Med, 2009, 6(4): 1000046.

[6] Wang S, Yin J, Li T, et al. Upregulated circulating miR-150 is associated with the risk of intrahepatic cholangiocarcinoma. Oncol Rep, 2015, 33(2):819-825.

[7] Alberti C. Cytoskeleton structure and dynamic behavior: quick excursus from basic molecular mechanisms to some implications in cancer chemotherapy. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2009, 13(1):13-21.

[8] Zhang HL, Jia AP, Xing L. Correlation between the expression of various tumor markers in the level of intraperitoneal drainage fluid in patients with colorectal cancer and its relationship with disease. Int J Lab Med, 2014, 35(1):105-106. (in Chinese)张海林, 贾爱萍, 邢丽. 多种肿瘤标志物在结直肠癌患者术后腹腔引流液中水平的表达与疾病的相关性研究. 国际检验医学杂志, 2014, 35(1):105-106.

[9] Palmqvist R, Engarås B, Lindmark G, et al. Prediagnostic levels of carcinoembryonic antigen and CA 242 in colorectal cancer: a matched case-control study. Dis Colon Rectum, 2003, 46(11):1538-1544.

[10] Haglund C, Lundin J, Kuusela P, et al. CA 242, a new tumour marker for pancreatic cancer: a comparison with CA19-9, CA50 and CEA. Br J Cancer, 1994, 70(3):487-492.

[11] Zhang LZ, Gong YF, Tu ZX. Quantitative determination of serum levels of CA242 in patients with pancreatic cancer and its significance. Chin J Pancreatol, 2002, 20(1):20-21.(in Chinese)张乐之, 龚燕芳, 屠振兴. 胰腺癌患者血清 CA242定量测定及其意义. 胰腺病学, 2002, 20(1):20-21.

[12] Engarås B. Individual cutoff levels of carcinoembryonic antigen and CA 242 indicate recurrence of colorectal cancer with high sensitivity. Dis Colon Rectum, 2003, 46(3):313-321.

[13] Gámiz-Gracia L, Garca-Campaña AM, Soto-Chinchilla JJ, et al. Analysis of pesticides by chemiluminescence detection in the liquid phase. TrAC Trends Anal Chem, 2005, 24(11):927-942.

Development of an automatic chemiluminescence test kit for detection of carbohydrate antigen 242

YANG Hong-bin, LIU Jiang-wu, WENG Zu-xing, HUANG Liu-nv, XU Fei-hai, SUN Xu-dong

ObjectiveTo develop a chemiluminescence microparticle immunoassay (CMIA) to detect serum human carbohydrate antigen 242(CA242) level.

MethodsBased on double antibody sandwich principle, we screened the paired combinations of four monoclonal CA242 specific antibodies. Parameters including sensitivity, precision, rate of recovery, and correlation assay were further evaluated in the assay.

ResultsThe reactivity of 7C10 (coated) -3H1 (labeled) was the highest and CA19-9 and CA50 do not interfere with the detection of CA242. The coefficient of variation of the assay was 3.0% and 5.7%. The sensitivity was 0.69 U/ml and the rate of recovery was 101.5%. The assay correlates well with the current commercial kit (y = 1.027x – 0.2991, r = 0.9911, P ＜ 0.05).

ConclusionThe assay performs well and all the testing operations are completed automatically.

Carbohydrate antigen 242; Double-antibody sandwich method; Chemiluminescence

SUN Xu-dong, Email: xudong.sun@innodx.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.008

100050 北京，首都医科大学附属北京天坛医院离退休办公室（杨红宾）；361022 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司（刘江武、翁祖星、黄刘女、徐飞海、孙旭东）

孙旭东，Email：xudong.sun@innodx.com

2017-04-05

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(3):238-241

Author Affiliations: Office of Retirement Services, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China (YANG Hong-bin); Xiamen Innodx Biotech Co. Ltd., 361022 China (LIU Jiang-wu, WENG Zu-xing, HUANG Liu-nv, XU Fei-hai, SUN Xu-dong)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):238-241