PES-HA生物复合材料的热稳定性和生物毒性

倪 卓，杨 莎，吴耿峰，潘田光，刘 学，任英华，林佩芳，林泽宇

1)深圳大学化学与环境工程学院，广东深圳518060；2)深圳市第六人民医院口腔科，广东深圳 518067

【化学与化工 / Chemistry and Chemical Engineering】

PES-HA生物复合材料的热稳定性和生物毒性

倪 卓1，杨 莎1，吴耿峰1，潘田光1，刘 学2，任英华2，林佩芳1，林泽宇1

1)深圳大学化学与环境工程学院，广东深圳518060；2)深圳市第六人民医院口腔科，广东深圳 518067

采用溶解超声方法制备聚醚砜(polyethersulfone, PES)-羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)生物复合材料．红外光谱显示该复合材料主要为物理结合；热重分析研究发现，该组复合材料的热稳定性随HA质量分数的增加而增加，热分解反应级数均为1；细胞毒性测试发现，该组材料毒性级别均为Ⅰ级，对MG-63细胞无毒．加入HA的PES能够使细胞在复合材料中相对增值率增大，改善细胞生物相容性；荧光倒置显微镜观察发现，细胞在材料浸提液中生长良好，已贴壁的细胞形态为梭形或多角形，折光性强，存在明显的细胞增殖．

生物材料；复合材料；聚醚砜；羟基磷灰石；热稳定性；分解动力学；细胞毒性

聚醚砜(polyethersulfone, PES)又称聚苯醚砜或聚芳醚砜， 是用于工业制造领域的特种工程材料， 聚醚砜分子同时具有苯环的刚性和醚基的柔性． 砜基与整个结构单元形成的大共轭体系，具有优良的热稳定性、化学稳定性、机械性能和电性能，是具有高热变形温度、高冲击强度和优良成型性的特种工程塑料[1-2]．这种材料易成型，经过高温高压或辐射消毒后材料力学性能不会劣化，符合医疗器械消毒要求[3-4]．尽管PES在生理环境中力学性能稳定，但其生物活性有限，无法在骨替代材料领域直接使用[3]，因此，可考虑将其作为复合材料基体，加入纳米羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)制成生物复合材料．nHA的微结构类似天然骨基质，可被骨组织直接利用．nHA分子和天然骨无机矿物质大小相近，有利于人体细胞和大分子对该材料的识别，提高材料的生物活性和生物相容性.nHA的低结晶度和含碳酸根特征，具有与骨键合的能力，有利于提供适宜的环境促进矿物的沉积和骨细胞的黏附[5-6]．均匀分散于聚合物之中的纳米羟基磷灰石能在单位体积内产生超大的界面积，能使聚合物纳米复合材料力学性能得到显著提高，同时生物相容性也得到提高[7-8]．

本研究以N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethyl-formamide,DMF)为溶剂，制备聚醚砜溶液．采用超声技术在聚醚砜溶液中分散纳米羟基磷灰石，制备不同质量比的PES-HA生物复合材料．采用热重分析法(thermogravimetricanalysis,TG)研究升温速率对热重曲线的影响，分析热分解动力学参数，可为该材料的理论研究和工程应用提供科学依据．

1 材料与方法

1.1 实验试剂及设备

聚醚砜购自吉林大学湖南中试化工厂；纳米羟基磷灰石(纯度97%)购自南京埃普瑞纳米材料有限公司；N, N-二甲基甲酰胺(DMF； 分析纯500 mL)， 购自天津市永大化学试剂有限公司；MG-63成骨细胞购自上海生命科学院；RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司；小牛血清购自美国Thermo Fisher公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS) 购自美国Hyclone公司； 噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide, MTT)购自美国Sigma公司；二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO) 购自美国Amresco公司．真空干燥箱和高压灭菌锅(HV-50)购自日本Hirayama公司；红外光谱仪(Sectrum One Version B型)购自日本日立公司； 同步热分析仪(STA409PC型)购自德国NETZSCH．

1.2 PES-HA复合材料的制备

以DMF为溶剂，加入nHA超声处理至形成均匀的悬浊液；以DMF为溶剂，加入聚醚砜，缓慢加热至聚合物充分溶胀，溶解成均一、稳定、透明的溶液；将nHA悬浊液与聚醚砜溶液混合，冷凝回流并搅拌，150 ℃反应2h后铸膜；制得HA质量分数分别为10%、20%和30%的PES-HA复合材料，记作复合材料A、B和C．

1.3 傅立叶红外光谱测试

采用红外光谱仪对PES-HA复合材料进行测试，波数范围为400～4 000 cm-1，扫描10次．

1.4 热稳定性分析测试

以Al2O3为参比物，采用同步热分析仪对PES和3种PES-HA复合材料进行热重分析，实验在氮气(流速为30 mL/min)气氛中进行，测试范围为300～800 ℃，分别以5、10、20和40 ℃/min的升温速率对样品进行扫描，记录测量结果．

1.5 力学性能测试

参照GB/T 1447—2005标准[9]，将样品制成Ⅱ型试样形式，采用万能电子拉力机，以5 mm/min速率启动拉伸实验．拉伸强度公式为

δ=F/(bd)

(1)

其中，δ为拉伸强度(单位：MPa)；F为试样在拉伸至断裂中受到的最大力(单位：N)；b和d分别为试样宽度和厚度(单位：mm)．

1.6 细胞毒性检测

将HA、PES和3种PES-HA复合材料进行高压灭菌，用RPMI1640培养液制备材料浸提液．培养MG-63细胞生长至对数期，弃原培养液，用PBS洗涤两次，胰蛋白酶消化贴壁细胞，用完全培养基配制成单个细胞悬液，细胞板计数，每孔2×104个接种在96孔板上(n=6)， 每孔体积200μL． 24h后细胞贴壁，换用材料浸提液分别连续培养1、2、3和4d后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，37 ℃孵箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μLDMSO，摇床震荡10min，使结晶物充分溶解．选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光密度值D(490)， 并记录结果．

2 结果与讨论

2.1 PES-HA复合材料的化学结构

图1 HA、PES和PES-HA复合材料的红外光谱图Fig.1 Infrared spectroscopy of HA, PES and PES-HA composites

2.2 PES-HA复合材料的热稳定性

PES-HA生物复合材料具备良好的热稳定性，在长期的机体环境及成型过程中能耐热耐高温．升温速率为20 ℃/min时，PES-HA复合材料热重曲线和热失重相关数据如图2和表1．聚醚砜外推起始分解温度te≈521 ℃， 热稳定性能良好． 在PES-HA复合材料中，随着w(HA)增加，其外推起始分解温度会随之升高，最大分解速率k、 最大分解速率对应的温度tm和最小剩余率wr也随之增加．这些TG曲线均呈台阶式走向，具有分解起始拐点和结束拐点，至分解结束拐点后趋于平缓，在736 ℃时仍不能完全分解． 其中，PES的最小剩余率低，w(HA)高的PES-HA复合材料的PES最小剩余率高．

图2 PES和PES-HA复合材料热失重曲线Fig.2 TG curves of PES and PES-HA composites

样 品te/℃k/min-1tm/℃wr/%tr/℃PES521.218.87554.043.11736.1复合材料A533.115.52568.854.84736.7复合材料B540.914.72563.164.04736.8复合材料C545.410.78569.869.24735.9

升温速率对PES及PES-HA复合材料热分解有重要影响．分别测量升温速率为5、10、20和40 ℃/min时， PES及PES-HA复合材料在不同升温速率下的热失重数据见表2. 随着升温速率的提升，外推起始温度和最大分解速率都不断升高，最小剩余率基本保持不变，失重曲线向高温区平移．热分解过程不仅表现在临界起始分解温度，而且表现在预分解时间．加热速率增加，不能提供足够的预分解时间，热分解呈滞后状态，在热分解曲线上表现为热分解在较高温区域进行．加热速率较慢，反映的热分解起始温度在时间上的滞后性．升温速率越快的热分解反应，会在短时间内结束，表现为热分解速率加快．

2.3 PES-HA复合材料热分解动力学

反应的动力学方程是由反应机理决定的，根据反应的热分析动力学方程

dα/dt=k(1-α)n

(2)

其中， dα/dt为反应速率；k为速率常数；α为热分解率；n为反应级数．

k随温度的变化规律可用Arrhenius方程[10]表示

其中，A为频率因子(或称指前因子)；E为反应活化能；R为气体常数；T为反应时的绝对温度．

用Kissinger法[12]求热力学参数，由式(3)可得

i=1, 2, …, 4(或5和6)

(4)

其中，βi为升温速率(一般为常数)；Tpi为等压条件下的绝对温度．

表2 PES和PES-HA复合材料不同升温速率的热失重数据

(5)

根据表2数据、式(4)和式(5)可求得PES-HA复合材料热分解力学参数，如表3．PES-HA复合材料热分解反应级数为1，不随w(HA)变化而改变；当w(HA)增加时，复合材料活化能增加，热稳定性增加．

表3 PES-HA热分解动力学参数

2.4 PES-HA复合材料力学性能

表4为PES和PES-HA复合材料力学性能．随着w(HA)增加，PES-HA复合材料的断裂伸长率和拉伸强度均降低，弹性模量增加．在该复合材料中，PES与HA为物理结合，纳米HA颗粒分散在PES基体中．HA为分散相，PES为连续相，随着w(HA)增加，PES链段间作用力减弱，其拉伸强度有所降低，w(HA)越高，这种链段间作用力减弱愈加明显．当w(HA)=10%时，复合材料的拉伸强度为65MPa，弹性模量为1.48GPa，可达到一些承力较低的骨的力学条件，如松质骨、颈骨和腰骨等[12-14]．

表4 PES和PES-HA复合材料力学性能

2.5 细胞毒性测试

细胞相对增殖率(relative growth rate, RGR)能够反映细胞增殖活性，可由D(490, 样品组)/D(490, 对照组)计得[15]. 毒性分级根据细胞相对增殖率大小取定一个范围，一般相对增殖率越高，毒性分级越低．细胞毒性分级标准[16]为：RGR≥100%为0级，75%～99%为Ⅰ级，50%～74%为Ⅱ级，25%～49%为Ⅲ级，1%～24%为Ⅳ级，0为Ⅴ级．0级和Ⅰ级表示无细胞毒性；Ⅱ级需要结合细胞形态分析综合评定；Ⅲ级以上表示有细胞毒性．本实验中各组材料细胞毒性均为Ⅰ级，对细胞无毒性，见表5．由表5可见，样品中HA的RGR相对最高，PES-HA复合材料的RGR高于PES，随着HA质量分数的增加，其RGR逐渐升高，毒性逐渐降低．

材料对细胞的毒性可以反映在对细胞形态的影响上，通过观察细胞形态可直观判断材料毒性，正常MG-63细胞的形态多为梭形或多角形[17-18]．图3为倒置显微镜下MG-63细胞在HA、PES和PES-HA复合材料环境培养2d后的生长形态．由图3(a)可见，已贴壁的细胞形态折光性强，多为梭形和多角形，存在明显活细胞增殖，无明显坏死．图3(b)显示细胞大部分为梭形，少量细胞呈球形，细胞贴壁聚集生长，数目较多，与对照组接近，可见HA对细胞增殖抑制作用较小．图3(c)细胞呈梭形或三角形，有少数球形细胞，细胞数目比HA少．图3(d)细胞呈梭形或三角形、细胞密度相对较稀疏．与图3(c)相比，图3(e)细胞数目增多，贴壁生长，呈梭形，可见早期分裂的圆形细胞，说明复合材料B对细胞增殖作用比复合材料A强．图3(f)大量细胞贴壁生长为正常活细胞，许多细胞首尾相连呈聚集状态，与复合材料B相比细胞密度增加，说明复合材料C对细胞增殖作用强．因此，随着HA质量分数增加，PES-HA复合材料对细胞的增殖作用增强．

表5 各组材料的细胞毒性测试结果1)

1) 对照组1～4 d 的D(490)依次为0.498、 0.724、 0.821和0.912；n=6.

图3 HA、PES和PES-HA复合材料对细胞形态的影响(放大倍数为400)Fig.3 HA, PES and PES-HA composite on cells morphology (magnification is 400)

结 语

PES-HA复合材料的红外光谱包含了PES和HA的特征峰，与基体材料相比，PES-HA复合材料峰值没有出现明显的偏移或者新峰出现，表明PES和HA主要是物理结合，该组复合材料热分解反应级数均为1，反应级数不随w(HA)的变化而改变．随着w(HA)增加，复合材料活化能增加，热稳定性增加，拉伸强度降低，断裂伸长率降低，弹性模量增大．该组PES-HA复合材料对MG-63细胞无毒，毒性级别均为Ⅰ级．HA加入PES中可以改善细胞生物相容性，细胞生长良好，折光性强，存在明显的细胞增殖，细胞形态为梭形或多角形．

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【中文责编：晨 兮；英文责编：新 谷】

2016-12-29；Accepted：2017-03-07

Professor Ni Zhuo. E-mail: royzhuoni@hotmail.com

Thermal stability and biotoxicity of PES-HA biocomposites

Ni Zhuo1, Yang Sha1, Wu Gengfeng1, Pan Tianguang1, Liu Xue2, Ren Yinghua2, Lin Peifang1, and Lin Zeyu1

1) College of Chemistry and Environmental Engineering，Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China2) Department of Stomatology, The Sixth People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518067, P.R.China

Polyethersulfone-hydroxyapatite (PES-HA) biocomposites were prepared by dissolving ultrasonic method. Infrared spectroscopy shows that the composites are mainly composed by physical bonding. The thermo gravimetric analysis indicates that the thermal stability of the composites increases with the increase of HA content and the thermal decomposition reaction order is about 1. Cytotoxicity test shows that the toxicity level of the material is gradeⅠ, and the composites have no toxicity to MG-63 cells. The addition of HA into PES results in a relative increase in the growth rate of cells for the composites, thus improving the cell biocompatibility. The cells grow well in the material extract, the adherent cells are spindle or polygonal, with strong refraction and obvious cell proliferation.

biological materials; composite materials; polyether sulfone; hydroxyapatite; thermal stability; decomposition kinetics; cytotoxicity

：Ni Zhuo, Yang Sha, Wu Gengfeng, et al. Thermal stability and biotoxicity of PES-HA biocomposites[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(3): 313-318.(in Chinese)

国家自然科学基金资助项目(51378315)；深圳市科技计划资助项目(JCYJ20140411094009912)

倪 卓(1963—)，男，深圳大学教授、博士生导师. 研究方向：生物材料和功能材料.E-mail：royzhuoni@hotmail.com

TB 332

A

10.3724/SP.J.1249.2017.03313

Foundation：National Natural Science Foundation of China (51378315); Shenzhen Science and Technology Research Foundation (JCYJ20140411094009912)

引 文：倪 卓，杨 莎，吴耿峰，等.PES-HA生物复合材料的热稳定性和生物毒性[J]. 深圳大学学报理工版，2017，34(3)：313-318.