高效液相色谱串联质谱同时测定猪肉中克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法学考察

高效液相色谱串联质谱同时测定猪肉中克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法学考察

郭丽娜 王蕾 金善玉

目的建立高效液相色谱串联质谱同时测定猪肉中克仑特罗和沙丁胺醇含量的方法学考察。方法以克仑特罗-D9、沙丁胺醇-D3为内标物，选择离子对为克仑特罗m/z 277→m/z 203；沙丁胺醇m/z 240→m/z 148；克仑特罗-D9 m/z 280→m/z 204；沙丁胺醇-D3 m/z 243→m/z 151。结果克仑特罗和沙丁胺醇的精密度和重复性良好、线性范围分别为13．18～79．08 ng/ml，9．85～59．10 ng/ml且回收率良好。结论建立的方法准确且灵敏度高，适用于克仑特罗和沙丁胺醇的残留量测定。

高效液相色谱串联质谱；克仑特罗；沙丁胺醇；方法学

β-受体激动剂是一类具有促进蛋白质合成、加速脂肪分解的兴奋剂。近年来，被一些不法畜产品生产者用作“饲料添加剂”。人类长期食用含有此类添加剂的猪肉或其内脏会产生心跳加快、心率失常、肌肉震颤等不良反应[1]。克仑特罗和沙丁胺醇已被我国列为禁用药[2]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪器 LC-2030c 3D高效液相色谱仪（日本岛津）；LCMS-8040三重四级杆质谱仪（日本岛津）；高速冷冻离心机（上海力申）；SartoriusPB-10型pH酸度计（赛多利斯）；BT125D型电子天平（赛多利斯）。

1.1.2 试剂 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、β-葡萄糖醛甙酶（CNW公司）、沙丁胺醇标准品（批号100204-200702，纯度99.50%，中国药品生物制品检定所）、盐酸克仑特罗标准品（批号11001，纯度99.1%，中国计量科学研究院）、克仑特罗-D9（纯度99.70%，进口）、沙丁胺醇-D3（纯度99.3%，进口）。其他试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液的制备

1.2.1 标准储备溶液的配制 准确称取适量的沙丁胺醇、盐酸克伦特罗标准品，用甲醇分别配制成100μg/ml的标准贮备液。

1.2.2 混合标准储备溶液的配制 分别吸取1.00 ml沙丁胺醇、克伦特罗标准储备溶液至100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。

准确吸取0.10、0.20、0.30、0.40、0.60 ml的克仑特罗和沙丁胺醇混合标准储备溶液（1 μg/ml)置于10 ml容量瓶中，分别加入浓度为1 μg/ml的克仑特罗-D9和沙丁胺醇-D3内标储备溶液0.5 ml用甲醇定容至刻度。

1.3 样品处理

1.3.1 样品提取 称取2 g样品于50 ml离心管中，加8 ml乙酸钠缓冲液，混匀，再加50 μl β-葡萄糖醛甙酶，混匀后，37℃水浴水解12 h。

加100 μl 100 ng/ml的内标工作液于待测样品中。置于水平振荡器振荡，离心，取上清液加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 ml，混匀，用高氯酸调节pH到1。离心后，将上清液转移到50 ml离心管中，用10 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH到11，加10 ml饱和氯化钠溶液和10 ml异丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液，提取，离心。转移全部有机相，用氮气吹干。加5 ml乙酸钠缓冲液，超声混匀后备用。

1.3.2 净化 将上述残渣溶液上阳离子交换小柱，依次用2 ml水、2 ml 2%甲酸水溶液和2 ml甲醇洗涤柱子并抽干，最后用2 ml的5%氨水甲醇溶液洗脱柱子上的待测成分，用氮气吹干。

准确加入200μl 0.1%甲酸/水-甲醇溶液（95+5），混匀并转移到1.5 ml离心管中，离心。

1.4 测定条件及过程

1.4.1 测定条件 柱温：30 ℃；流速：0.2 ml/min；离子源：电喷雾（ESI），正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）。流动相：A：0.1%甲酸/水，B：0.1%甲酸/乙腈。

1.4.2 测定过程 将样品和标准使用液注入仪器，以其标准溶液的定量子离子的保留时间为依据，用内标法求出样液中被测物质的含量。

2 结果与分析

2.1 线性范围

由标准曲线表明，克仑特罗的浓度在13.18～79.08 ng/ml范围，呈良好的线性关系，回归方程为y=0.981 6x+0.028 1，相关系数R2=0.999 4；沙丁胺醇的浓度在9.85～59.10 ng/ml范围，呈良好的线性关系，回归方程为y=1.114 9x-0.015 8，相关系数R2=0.998 9。

2.2 检出限

将克仑特罗和沙丁胺醇标准品溶液逐级稀释，以信噪比为3：1或2：1时相应浓度作为检出限。计算得出克仑特罗和沙丁胺醇的检出限分别为0.036 μg/kg、0.015 μg/kg。

2.3 精密度

将同一样品连续进样6次，每次2 μl，测定其峰面积与内标物峰面积比值，计算克仑特罗和沙丁胺醇峰面积比值的相对标准偏差分别为1.9%、2.1%，表明精密度良好。

2.4 重复性

称取2.0 g试样6份，精密加入浓度为1 μg/ml的克仑特罗-D9和沙丁胺醇-D3内标储备溶液0.01 ml，余下过程同1.3。由表1可见，使用该方法测定克仑特罗和沙丁胺醇的相对标准偏差较小，表明重复性良好。

2.5 回收率试验

称取1.0 g试样6份，加入不同体积的混合标准储备溶液及内标储备液，余下制备及测定过程同1.3及1.4。克仑特罗的回收率在105.16%～109.77%，RSD为1.7%；沙丁胺醇的回收率在102.87%～107.38%，RSD为1.9%。表明方法可行。

3 讨论

畜产品中β-受体激动剂的残留会使食用者产生蓄积中毒，严重危害国内的食品安全。目前，针对克仑特罗的残留检测方法主要有高效液相色谱串联质谱法[3]、气相色谱法[4]、超高效液相色谱-串联质谱法[5]和ELISA法[6]等；而对沙丁胺醇的残留检测方法主要有气相色谱-质谱法[7]、高效液相色谱法[8]和ELISA法[9]等。本文采用液相色谱-串联质谱法对猪肉中克仑特罗和沙丁胺醇残留量的同时测定进行了方法学验证，结果证明该方法简便、准确，适用于β-受体激动剂的残留量测定。

表1 克仑特罗和沙丁胺醇的重复性试验结果（单位：μg/kg）

[1] 马林． 关于“瘦肉精”的危害、检测技术和监管[J]． 甘肃畜牧兽医，2016，46（18）：20-21．

[2] 康升云． β受体激动剂对畜产品安全的影响[J]． 中国畜牧兽医文摘，2012，28（7）：211，96．

[3] 吴泽君，龙凌云，郭世明． 高效液相色谱-串联质谱法研究猪毛发中克仑特罗和莱克多巴胺的残留及代谢规律[J]． 中国兽药杂志，2010，44（8）：22-26．

[4] 谢维平，黄盈煜，胡桂莲． 气相色谱法直接测定动物组织中盐酸克仑特罗的残留量[J]． 色谱，2003，21（2）：192．

[5] 孙涛，刘圣红，乔昆云，等． 超高效液相色谱-串联质谱法测定猪尿中9种β-受体激动剂残留[J]． 分析仪器，2012（3）：36-39．

[6] 孔科，袁宗辉，范盛先． 克仑特罗在猪肝脏中残留检测的ELISA法研究（英文）[J]． 华中农业大学学报，2000，19（3）：252-255．

[7] 吴银良，刘素英，刘勇军，等． 固相萃取-气相色谱-质谱法测定猪组织中沙丁胺醇残留量[J]． 分析化学，2006，34（s1）：23-26．

[8] 金雁，姚家彪，郭隽，等． 猪肉中克仑特罗、沙丁胺醇、土霉素、四环素残留量的HPLC同时测定方法研究[J]． 检验检疫科学，2008，18（5）：30-33．

[9] 孟萌，张玉兰，卢圣欣，等． 以新型沙丁胺醇抗原为基础建立ELISA法测定沙丁胺醇残留量（英文）[J]． 药学学报，2010，45（4）：442-450．

The Methodology of HPLC-Ms Method for Simultaneous Determination of Clenbuterol and Salbutamol in Pork

GUO Li'na WANG Lei JIN Shanyu The Physical Chemistry of Food Off i ce, Yanbian Institute for Food and Drug Control, Yanji Jilin 133000, China

ObjectiveTo develop a HPLC-Ms method for simultaneous determination of clenbuterol and salbutamol in pork.MethodsClenbuterol-D9 and Salbutamol-D3 were used as internal standard and the ion pair for Clenbuterol m/z 277 → m/z 203; Salbutamol m/z 240 → m/ z 148; Clenbuterol-D9 m/z 280 → m/z 204; Salbutamol-D3 m/z 243 →m/Z 151.ResultsThe precision and reproducibility of clenbuterol and salbutamol were good, the linear range was 13.18 to 79.08 ng/ml, 9.85 to 59.10 ng/ml and the recovery rate was good.ConclusionThis method is accurate and sensitive and it is suitable for the determination of the amount of Salbutamol and Clenbuterol residues.

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; clenbuterol; salbutamol; methodology

S859．84

A

1674-9316（2017）11-0012-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．11．006

延边州食品药品检验所食品理化室，吉林 延吉 133000

金善玉