蓖麻玆cAKT1基因的克隆与序列分析

包丽坤 耿学军

摘要[目的]对蓖麻RcAKT1基因进行克隆和序列分析。[方法]提取盐胁迫处理的蓖麻新鲜叶片总RNA，采取RACE法克隆蓖麻RcAKT1基因的3′末端和5′末端，利用生物信息学软件DNAman對两端序列进行拼接，最后设计一对特异性引物，从而获得蓖麻RcAKT1基因的ORF全长序列，并对该序列进行生物信息学分析。[结果]该基因的开放阅读框序列长度为2 253 bp，推测可不间断编码751个氨基酸。选取其他植物的AKT1序列与蓖麻RcAKT1序列进行比对，结果显示同源性很高，其一致性在84%～97%。[结论]经过生物信息学分析，发现蓖麻RcAKT1属于ANK超级家族，是亲水性蛋白质。

关键词蓖麻；内整流K+通道蛋白基因；基因克隆；生物信息学分析

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）21-0138-05

Cloning and Sequence Analysis of RcAKT1 Gene from Castor

BAO Likun，GENG Xuejun

（College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）

Abstract[Objective]To clone and analyze RcAKT1 gene sequence from castor.[Method]The total RNA of castor fresh leaves was extracted and the RACE method was used to clone the 3 ′end and 5′ end of RcAKT1 gene. The twoterminal sequence was spliced by bioinformatics software DNAman.Finally，the ORF full length sequence of RcAKT1 gene was obtained and the bioinformatics analysis was carried out.[Result]The length of the open reading frame was 2 253 bp， the analysis predicted that 751 amino acids could be encoded without interruption. The AKT1 sequence of other plants was compared with the RcAKT1 sequence of castor.The results showed that the homology was high and the consistency was between 84% and 97%.[Conclusion]After bioinformatics analysis， it has been found that castor RcAKT1 belongs to the ANK super family and its a hydrophilic protein.

Key wordsCastor； ATK1；Gene cloning；Bioinformatic analysis

植物K+通道蛋白（Arabidopsis K+ transporter 1，AKT1）是一個在高亲和钾离子的吸收过程中发挥重要作用的内向整流的钾离子通道，它在植物中的主要作用是负责介导参与其对钾离子的吸收以及钾离子的运输，在水分子的胁迫下可以降低蒸腾、关闭气孔，进而有效地防止植物体内水分流失，维持光合作用从而增加其抗逆性[1-2]。在很多抗逆性强的植物体内的抗逆机制中，AKT1基因发挥了非常大的作用。因此，对该基因的研究具有很大的现实应用性价值。

蓖麻（Ricinus communis L.）属于大戟科植物，是一年生或多年生的草本植物。我国土地沙漠化越来越严重，且在农业种植土地总面积当中盐碱土地面积一直占有很大的比例，由于在盐碱土地上种植其他农作物产量很低，所以大部分地区都选择种植抗盐碱性强的农作物。蓖麻的适应性相对于其他植物较强，其可在气候干旱少雨、土地贫瘠且盐碱含量高的地区进行种植，因此它的种植非常广泛。此外，蓖麻的经济地位和应用价值也非常高，现已被应用到了各行各业，目前对蓖麻的抗逆性研究较少。该研究以蓖麻为材料，采用RACE（rapidamplification of cDNA ends）等技术，获取蓖麻K+通道蛋白基因RcAKT1，并进行生物信息学分析，为进一步研究RcAKT1基因的转化及功能验证奠定基础。

1材料与方法

1.1材料蓖麻品种为通蓖5号，

首先对蓖麻进行盐胁迫预处理，待其长出3片真叶后，将新鲜叶片用液氮进行速冻保存，作为试验材料备用。Ex Taq DNA聚合酶、克隆载体PMD18-T、3′RACE 试剂盒以及5′RACE 试剂盒均来自宝生物工程（大连）有限公司，大肠杆菌JM109感受态细胞采用钙离子处理法制备，并且保存于实验室超低温冰箱内，其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1蓖麻叶片总RNA的提取及引物设计。创造一个无RNase的环境，使用改良的Trizol提取法在蓖麻新鲜叶片中提取总RNA，将没有蛋白质和DNA污染、降解程度低、丰度高的总RNA进行分装保存。该试验以RNA为模板，采用RACE法克隆蓖麻RcAKT1基因cDNA的全长序列[3]。根据其他亲缘关系较近植物中RcAKT1基因的进化保守区域序列，利用Premier 5.0软件，设计出一对3′RACE简并性引物：BMF1和BMF2。结合获取的蓖麻RcAKT1基因3′末端序列，再利用Premier 5.0软件，设计出一对5′RACE特异性引物：BMR1和BMR2。将经公司测序得到的核苷酸3′末端序列以及5′末端序列利用DNAman软件进行电子序列拼接，最终获得cDNA全长核苷酸序列。找出该基因序列的开放阅读框，在序列编码区两端设计出一对全长特异性引物：F和R，进行RcAKT1基因全长克隆。引物序列详见表1。

1.2.2蓖麻RcAKT1基因全长序列的获取。

蓖麻RcAKT1基因3′末端序列的克隆是参照3′RACE试剂盒的说明书进行的，以蓖麻叶片总RNA为模板，3′RACE Adaptor（来自3′ RACE试剂盒）为反转录引物获取cDNA第一条链，反应条件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min；4 ℃保存。Outer PCR使用引物BMF1和3′ RACE Outer primer（来自3′ RACE试剂盒），反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25个循环，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。Inner PCR使用引物BMF2和3′ RACE Inner primer（来自3′ RACE试剂盒），反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25个循环，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。蓖麻RcAKT1基因5′末端序列的克隆是参照5′ RACE试剂盒的说明书进行的，以Random 9 mers（来自5′ RACE试剂盒）为反转录引物获取cDNA第一条链。Outer PCR使用引物BMR1和5′ RACE Outer primer（来自5′ RACE试剂盒），反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25个循环，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。Inner PCR使用引物BMR2和5′ RACE Inner primer（来自5′ RACE试剂盒），反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25个循环，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。逆转录使用Oligo dT为引物，反应条件：65 ℃ 5 min；42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min；4 ℃保存。目的基因全长克隆使用引物R和F，反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 40 s；72 ℃ 90 s；30个循环，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。利用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，与PMD18-T连接，重组载体转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选和蓝白斑筛选，提取质粒，进行质粒PCR和双酶切鉴定，将疑似阳性克隆菌送至北京华大基因测序。

1.2.3蓖麻RcAKT1基因生物信息学分析。

将经过生物公司测序得到的核苷酸序列进行一系列分析，發现该序列具有完整的开放阅读框，并确定该开放阅读框为蓖麻RcAKT1基因cDNA的全长序列。利用NCBI、TMHMM网站以及DNAman、ClustalX、MEGA5.2等生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行氨基酸序列预测，分析出该基因的理化性质、亲水性、疏水性，蛋白质的跨膜结构区，并将蓖麻与其他几种植物的AKT1序列进行多重序列比对，观察序列的一致性。构建蓖麻与这几种植物K+通道蛋白序列系统进化树。

2结果与分析

2.1蓖麻RcAKT1基因的全长克隆

将在蓖麻新鲜叶片中提取的总RNA進行0.1%琼脂糖凝胶电泳检测，在电泳图上显示出清晰的3条带，其中第2条带最亮，第3条带最暗，充分说明提取的总RNA中蛋白质和DNA的污染少、降解量低且丰度较高，表明其质量非常好（图1）。以蓖麻叶片总RNA为模板，设计引物，利用RACE的方法先后克隆出蓖麻RcAKT1基因的3′末端和5′末端，将经公司测序得到的3′末端序列和5′末端序列利用DNAman软件进行拼接，从而得到目的基因的全长序列[4]，并根据该全长序列设计一对特异性引物，进行PCR克隆，电泳图显示在2 253 bp处得到一条清晰的条带，该条带长度完全符合两条引物间的序列长度。可确定该PCR产物为目的基因的ORF全长序列（图2），命名为蓖麻RcAKT1。

2.2蓖麻RcAKT1基因的生物信息学分析

将获得的目的基因3′末端与5′末端核苷酸序列利用DNAman软件进行电子序列拼接，得到RcAKT1基因的ORF全长序列[5]。利用生物信息学软件对该基因的核苷酸序列进行理化性质分析，发现该序列的开放阅读框为2 253 bp，推测可不间断编码751个氨基酸（图3），分子量为84.043 ku，等电点（PI）值为6.35，pH=7.0时电荷为-7.52，同时对预测的RcAKT1氨基酸序列进行了亲水性和疏水性分析，在图中显示其亲水性的平均值为正值，疏水性的平均值为负值，因而断定该蛋白为亲水性蛋白（图4）。将RcAKT1基因的氨基酸序列在NCBI网站上进行Blast比对，发现蓖麻与其他植物该基因的氨基酸序列同源性很高，均为84%～97%（图5），将与蓖麻亲缘关系较近植物（胡杨、木本棉、葡萄、麻疯树、胡桃）的AKT1氨基酸序列，使用DNAman软件与蓖麻进行多重序列比对，结果表明其一致性达77.17%（图6）。利用NCBI网站的Conserved Domains （http：// www.ncbi. Nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb/cgi）预测RcAKT1基因具有的保守区域，假定保守域检测结果显示该基因属于ANK超级家族，猜测蓖麻RcAKT1基因与这个家族中所包含的其他所有基因具有一样的功能（图7）。将基因的氨基酸序列利用网络上的服务器TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜区的结构分析，跨膜结构分析的结果发现该蛋白的氨基酸序列共包含了5个跨膜结构区，由此推断蓖麻RcAKT1为跨膜蛋白，并且该蛋白的跨膜结构区全部集中在N端，而C端不含跨膜结构区（图8）。

3结论与讨论

内整流K+通道蛋白基因在植物的抗逆方面起到非常重要的作用，该试验利用RACE法克隆出蓖麻RcAKT1基因的cDNA全长序列，该序列长度为2 253 bp，推测可不间断编码751个氨基酸。选取其他植物的内整流K+通道蛋白序列与蓖麻的AKT1序列进行比对，结果显示同源性很高，其一致性在84%～97%。经过生物信息学分析，发现蓖麻丝氨酸/苏氨酸激酶属于ANK超级家族，是亲水性蛋白质。

通过对RcAKT1基因序列的生物信息学分析，在分子水平预测其结构与功能特性，可以更好地掌握它的作用机制，也为研究其他与抗逆相关的基因奠定了坚实的基础。植物的抗逆是一个十分复杂的过程，是由植物体内多个基因相互

协调作用的结果[6]，为进一步研究蓖麻的抗逆过程，首先要在蓖麻体内克隆出所有与抗逆相关的基因，并探索出这些基因的相互作用机制，今后可以利用转基因的手段，将这些抗

逆基因转入到其他抗逆性差的植物体内，有望在提高植物的

抗逆性方面取得重要突破，为农作物生产和应用做出贡献。同时，还可以采取分子生物学的一些方法研究该基因，并进一步转化到蓖麻植株内，以培育出抗逆效果更加显著的蓖麻新品种。

参考文献

[1]

伍国强，水清照，冯瑞军.植物K+通道AKT1的研究进展[J].植物学报，2017，52（2）： 225-234.

[2] 胡静，胡小柯，尉秋实，等.植物内整流K+通道AKT1的研究进展[J].草业科学， 2017，34（4）：813-822.

[3] 杨玲玲. RACE法克隆紫花苜蓿光敏色素A基因[D].郑州：河南农业大学，2008.

[4] 宋笛. Race方法克隆云芝免疫调节蛋白基因[J].农业与技术，2016，36（17）：21-23.

[5] 崔素萍，刘博，黄丽丽，等.利用RACE方法克隆小麦β-1，3-葡聚糖酶基因的全长cDNA[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（7）：79-84.

[6]于鸿燕.草鱼三个PI3K/AKT通路相关基因的克隆和表达分析[D].上海：上海海洋大学，2015.