铁皮石斛多倍体诱导研究

马仲强 刘太林 施梅 付璐璐 张雨琦

摘要[目的]研究铁皮石斛的多倍体诱导。[方法]以铁皮石斛蒴果为材料，诱导萌发出铁皮石斛圆球茎，研究不同浓度的NAA、6-BA对铁皮石斛圆球茎增殖的影响；以秋水仙素作为诱导剂，研究不同浓度秋水仙素、处理时间对多倍体铁皮石斛诱导的影响。[结果]NAA浓度为1.5 mg/L、6-BA浓度为2.0 mg/L时，铁皮石斛圆球茎增殖效果最好；秋水仙素浓度越低、处理时间越短时，成活率越高、诱导率相对较低；随着秋水仙素浓度增大，处理时间延长，诱导率升高，但死亡率增大。[结论]秋水仙素浓度在0.15%、处理时间为48 h时，成活率达40%，诱导率为30%，效果最好。

关键词铁皮石斛；秋水仙素；多倍体；组织培养

中图分类号S567.23文献标识码A文章编号0517-6611（2017）21-0135-03

Study on Polyploid Induction of Dendrobium officinale

MA Zhongqiang，LIU Tailin*，SHI Mei et al

（Tianjin Tianshi College， Tianjin 301700 ）

Abstract[Objective] The research aimed to study the polyploid induction of Dendrobium officinale.[Method]Dendrobium officinale capsule were used as materials to induce round bulb，the effects of different concentrations of NAA and 6BA on the proliferation of round bulbs of Dendrobium officinale were studied.The effects of different concentrations of colchicines and treatment time on the induction of polyploid Dendrobium officinale were studied by using colchicine as an inducer.[Result]When the concentration of NAA was 1.5 mg/L， the concentration of 6BA was 2.0 mg/L， the effect of the proliferation of round bulbs of Dendrobium officinale was the best.The colchicine concentration was lower， treatment time was shorter， the survival rate was higher， the induction rate was relatively low；with the increase of colchicine concentration and treatment time prolonged， the induction rate increased， but increased mortality.[Conclusion] When the concentration of colchicine was 015% and the treatment time was 48 h， the survival rate was up to 40%， and the induction rate was the best， which was 30%.

Key wordsDendrobium officinale；Colchicine；Polyploid；Tissue culture

铁皮石斛 （Dendrobium officinale）是兰科石斛属多年生附生草本植物，是国家重点保护药用植物[1]，多附生于海拔500～1 600 m林中石上或树上，喜温暖湿润气候，好半阴半阳环境，不耐寒，但有报道其在-5 ℃的低温下仍能存活[2]。铁皮石斛含有石斛碱、石斛多糖、蛋白质、17种氨基酸和7种无机元素[2-3]，具有益胃生津、润肺止咳、滋阴清热、养阴生津、润喉护嗓、温胃明目、补肾益力、延年益寿等功效，可增强免疫力、提高抵抗力、消除肿瘤、抑制癌症，对白内障、关节炎、胃肠道疾病、慢性咽炎及血栓闭塞性脉管炎等疾病有很好的治疗效果[1-4]。石斛属植物主要集中生长在亚洲热带、亚热带和大洋洲等地区，我国药用石斛主要分布于安徽、江西、浙江、福建、四川、广西和云南等地，其中以云南的产量最大。

铁皮石斛对自然的生长条件要求十分苛刻，自然产量极为稀少，而傳统的扦插和分株等人工繁殖方式速度慢、效率低，随着其药用价值逐渐被消费者熟知和认可，市场日益扩大，过量采集加上生态环境的破坏导致了野生资源濒临枯竭[5]。为了满足日益增大的市场量需求，用多倍体诱导的方法来增大铁皮石斛的产量[6-8]，提高活性成分的含量，以期为农业生产提供优质的种质资源。笔者以铁皮石斛蒴果为材料，诱导萌发出铁皮石斛圆球茎，探讨不同浓度的NAA、6-BA对铁皮石斛圆球茎增殖的影响；以秋水仙素作为诱导剂，研究不同浓度秋水仙素、处理时间对多倍体铁皮石斛诱导的影响。

1材料与方法

1.1试验材料与试剂

未萌发的鐵皮石斛蒴果购于乐清海上名山铁皮石斛基地，部分铁皮石斛组培苗由生物与食品工程学院提供；MS培养基及相关激素NAA、6-BA购于上海蓝季科技发展有限公司；秋水仙素购于东洋纺生物科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1无菌体系的建立。

打开超净工作台，紫外灭菌30 min，用酒精棉球将超净工作台擦拭干净，然后开始进行无菌体系的建立。

即用流水将铁皮石斛蒴果表面冲洗干净，冲洗3～5 min；

将冲洗干净的铁皮石斛蒴果放在0.1%氯化汞溶液中浸泡大约15 min；

然后放在75%乙醇中消毒30 s；

取出消毒完的蒴果用无菌水冲洗4～5遍，用灭菌的滤纸吸干表面水分，放置于灭菌的培养皿中；

用刀片将铁皮石斛蒴果切开，均匀地播种于种子萌发的培养基中。

1.2.2种子的萌发培育。

根据参考文献[9]得知，选用1/2MS培养基，加入0.2 mg/L NAA，圆球茎增殖效果最好，根据以上数据配置铁皮石斛种子萌发培育的培养基，将购买的铁皮石斛蒴果接种于培养基上，获得铁皮石斛圆球茎（图1）用于后续试验。

1.2.3铁皮石斛圆球茎的增殖培养。选用MS培养基，加入不同浓度的NAA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）；选取直径为0.5～1.0 cm的圆球茎接种到上述培养基中进行增殖培养。

1.2.4铁皮石斛圆球茎的诱导处理。取出大约8 mL的秋水仙素放入15 mL离心管中，灭菌；取出灭菌的秋水仙素冷却至室温，用灭菌的去离子水将其稀释成不同浓度的秋水仙素溶液（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）；將选取的铁皮石斛

圆球茎放入上述不同浓度秋水仙素溶液的离心管中，秋水仙素处理铁皮石斛到达不同时间（12、24、36、48、60 h）后，倒出秋水仙素，用无菌水冲洗3～5次；将无菌水冲洗完的圆球茎放入灭菌培养皿中，用灭菌的滤纸吸干多余水分；最后将处理完的铁皮石斛圆球茎接种到培养基中[6-8]。

1.2.5多倍体植株的鉴定。

1.2.5.1

材料前处理。取分生组织较强的部位，如根尖、愈伤组织等，取根尖大约0.5 cm左右，置于秋水仙素、8-羟基喹啉或对二氯苯等溶液中低温处理一定的时间。

1.2.5.2植株鉴定。

用卡诺式固定液固定30 min以上，

用蒸馏水浸泡冲洗20 min以上（注意换水）。

用纤维素酶和果胶酶各2.5%的混合酶酶解30 min，

洗去材料表面残留的酶液。

用1 mol/L HCL在60 ℃水浴中解离10 min。

最后用改良品红溶液染色5～10 min，压片，镜检[10]。

2结果与分析

2.1不同浓度NAA、6-BA对铁皮石斛圆球茎继代培养的影响

从表1可以看出，当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度增加，增殖强度逐渐增大，而后减小，当NAA浓度达2.5 mg/L时，增殖强度普遍较低，6-BA浓度在1.5、20 mg/L时，增殖强度较高，当6-BA浓度达2.0 mg/L以上时，增殖强度明显过低。

当6-BA浓度一定时，随着NAA浓度的增大，增殖强度逐渐增大，而后减小，但效果不明显，NAA浓度在1.0、1.5、20 mg/L时，增殖强度相对较好；NAA浓度在0.5、2.5 mg/L时，增殖强度较差。

由以上数据可以得出，细胞生长素与细胞分裂素在不同

比例时，铁皮石斛圆球茎增殖效果不同，当NAA浓度为1.5 mg/L、6-BA浓度为2.0 mg/L，45 d时增殖率高达80%，增殖效果最好。

2.2不同浓度的秋水仙素及处理时间对铁皮石斛诱导的影响

从表2可以看出，秋水仙素浓度越低、处理时间越短时，成活率越高、诱导率相对较低；随着秋水仙素浓度增大，处理时间延长，诱导率升高，但死亡率增大。当秋水仙素浓度在一定时，处理时间在24 h以下时，成活率基本在70%以上；

当处理时间在60 h以上时，成活率基本低于50%；当处理时

间在24～48 h时，诱导率基本在20%～30%，成活率相对较高，效果较好，随着秋水仙素浓度的增加，当秋水仙素浓度达0.15%、0.20%时，诱导率较高，高达30%。

根据综合情况考量，秋水仙素浓度为0.15%、处理时间为48 h时，成活率达40%，诱导率达30%，效果最好。

2.3多倍体植株的鉴定通过植物显微技术，观察得到的铁皮石斛圆球茎如图2～4。诱导处理过的铁皮石斛圆球茎多为二倍体与四倍体混合形成的，为嵌合体。培育形成的多倍体铁皮石斛具有较好的抗逆性、较高的适应性。

3结论与讨论

秋水仙素浓度越低，处理时间越短时，成活率越高、诱导率相对较低；随着秋水仙素浓度增大，处理时间延长，诱导率升高，但死亡率增大。综合考量，秋水仙素浓度在0.15%、处理时间为48 h时，成活率达40%，诱导率为30%，效果最好。当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度增加，增殖强度逐渐增大，而后减小；当6-BA浓度一定时，随着NAA浓度的增大，增殖强度逐渐增大，而后减小。综合考量，NAA浓度为1.5 mg/L、6-BA浓度为2.0 mg/L时，铁皮石斛圆球茎增殖效果最好。

诱导处理过的铁皮石斛圆球茎多为二倍体与四倍体混合形成的，为嵌合体，后期应以嵌合体圆球茎培育出来的幼

苗，用根尖观察鉴定，进一步确定形成的多倍体铁皮石斛数量。

培育形成的多倍体铁皮石斛具有较好的抗逆性、较高的适应性，将培育好的铁皮石斛圆球茎培育成幼苗，成长成植株，可以通过气孔观察、叶片厚实程度、有效成分含量来进一步验证多倍体铁皮石斛在原有基础上的优势。

参考文献

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安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（21）：146-150