超高效液相色谱法测定烟用水基胶中3种异噻唑啉酮杀菌剂

姬厚伟，董 睿，刘 剑，张 丽，王 芳，黄锡娟，彭黔荣

（贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵阳550009）

超高效液相色谱法测定烟用水基胶中3种异噻唑啉酮杀菌剂

姬厚伟，董 睿，刘 剑＊，张 丽，王 芳，黄锡娟，彭黔荣

（贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵阳550009）

采用超声提取－超高效液相色谱法同时测定烟用水基胶中3种异噻唑啉酮类化合物的含量。样品0.300 0g经20mL甲醇（1＋1）溶液超声提取30min后，提取液在Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱上分离，以水－乙腈混合液为流动相进行梯度洗脱，采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为275nm和318nm。3种异噻唑啉酮类化合物的质量浓度在一定范围内与其峰面积呈线性关系，检出限（3S／N）在0.005～0.01mg·L－1之间，测定下限（10S／N）在0.015～0.03mg·L－1之间。加标回收率在92.2%～100%之间，测定值的相对标准偏差（n＝6）在1.2%～6.0%之间。

超高效液相色谱法；超声提取；异噻唑啉酮；烟用水基胶

异噻唑啉酮类衍生物是含有噻唑啉酮环的一类化合物总称，其结构式见图1。R1和R2可为H、卤素、烷基、环烷基等，R0则可为烷基、环烷基、芳烷基、芳烃基或带有取代基的6个碳原子的芳烃基等［1］。因其具有抗菌能力强、应用剂量小、溶解性好、低毒性、低残留、易降解等优点，已成为当前防腐杀菌剂研究开发主流，并被广泛应用于防污涂料、工业用水、皮革、化妆品、造纸、胶粘剂、医药、农业等多个领域［2］。

水基胶是通过乳液聚合而成的含水胶乳，易受微生物侵袭，而异噻唑啉酮的添加可以起到杀菌防腐的作用。但研究发现，暴露在环境中的异噻唑啉酮类化合物会存在健康隐患，如甲基异噻唑啉酮具有一定的细胞毒性和神经毒性，与皮肤接触有过敏性反应等［3－5］。国内外对玩具、食品、化妆品等领域中异噻唑啉酮类杀菌剂的用量、残留量和特定迁移量都有严格的管控，如欧盟玩具安全标准EN 71－9－2005规定2－甲基－3（2H）－异噻唑啉酮（MI）、5－氯－2－甲基－2H－异噻唑－3－酮（CMI）和1，2－苯并异噻唑基－3（2H）－酮（BIT）的限量分别为10，10，5mg· kg－1，并且MI和BIT总限量为15mg·kg－1［6］；我国GB 9685－2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》规定MI、CMI和BIT的特定迁移限量分别为0.5，0，1.2mg·kg－1［7］；我国和欧盟化妆品法规对MI和BIT的限量均分别为0.01%，0.001 5%［8］。由于烟用水基胶可能会直接接触消费者的口腔，异噻唑啉酮的加入量直接影响到吸食安全性。因此，建立水基胶中异噻唑啉酮含量的测定方法对产品质量安全管控尤为必要。

图1 异噻唑啉酮类衍生物的结构式Fig.1 Structral formula of isothiazolinone derivatives

目前，异噻唑啉酮类化合物的测定方法主要有紫外分光光度法［9］、高效液相色谱法［10－12］、气相色谱法［13－14］、气相色谱－质谱法［15］、液相色谱－串联质谱法［16－20］等。水基胶中异噻唑啉酮类化合物的测定方法有高效液相色谱法［21－22］和液相色谱－串联质谱法［23］，而超高效液相色谱法尚无报道。相比之下，高效液相色谱法分析时间长，液相色谱－串联质谱法设备要求高，而超高效液相色谱是一种基于小颗粒填料技术，具有超高速度、超高分离度和超高灵敏度的新一代液相分离技术。本工作采用超高效液相色谱法测定烟用水基胶中的MI、CMI和BIT等3种异噻唑啉酮的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters AcquityTM型超高效液相色谱仪（UPLC），配二元溶剂管理系统、二极管阵列检测器（PDA）和Waters Empower 2色谱工作站；TGL－ 20B型高速台式离心机；Milli－Q integral 15型纯水系统；KQ－500DE型数控超声清洗器；AG 104型分析天平。

混合标准溶液：分别称取MI、CMI、BIT标准品为0.100 0，0.025 0，0.100 0g，混合于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，得到混合标准储备溶液。移取5，10，50，100，250，500μL混合标准储备溶液于6只25mL容量瓶中，用水定容，摇匀，得到不同质量浓度的混合标准溶液。

MI（纯度99%）、CMI（纯度99%）、BIT（纯度99%）标准品。

烟用水基胶选自卷烟企业；甲醇为色谱纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱温35℃；进样量8μL；流量0.2mL·min－1。0～3.4min时，检测波长为275nm；3.4～4.0min时，检测波长为318nm。流动相A为水，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～4min时，B由0.1%升至40%；4～5min时，B由40%降至0.1%，保持2min。

1.3 试验方法

称取样品0.300 0g于50mL具塞三角瓶中，先加入水10mL，轻微摇晃使水基胶均匀分散，再加入甲醇10mL，混匀后，超声30min，转移至50mL离心管中，以9 000r·min－1转速离心5min，取2mL上清液，用氮吹浓缩至1mL后（不足1mL时加入水定容至1mL），过0.22μm水相滤膜于色谱瓶，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

试验比较了同一质量浓度的混合标准溶液在BEH Shield RP18（2.1mm×50mm，1.7μm）、BEH Phenyl（2.1mm×50mm，1.7μm）、BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）和HSS T3（2.1mm× 50mm，1.8μm）等Waters UPLC系统专用色谱柱上的分离效果，结果见图2。

由图2可知：使用BEH Shield RP18色谱柱，MI出峰时间为1.7min左右，出峰时间太快，遇到复杂样品基质时可能会有干扰物；BEH Phenyl色谱柱上CMI和BIT峰形展宽且拖尾较为严重；BEH C18色谱柱上BIT响应值较低；HSS T3色谱柱上MI的出峰时间为4种型号色谱柱中最晚的，约在2.0min，且3种化合物的响应都很好。试验选择HSS T3色谱柱为分离柱。

图2 混合标准溶液在不同色谱柱上的色谱图Fig.2 Chromatograms of mixed standard solution on different chromatographic columns

2.2 提取溶剂的选择

通过考察提取率对提取溶剂进行优化，结果见表1。

由表1可知：当用甲醇（1＋1）溶液作提取溶剂时，提取效果最佳，3种化合物的提取率在91.5%～94.7%之间。试验选择甲醇（1＋1）溶液为提取溶剂。

表1 使用不同提取溶剂的提取率Tab.1 Extraction efficiency by using different extraction solution%

试验还发现：MI由于较强的溶剂效应表现出色谱峰明显展宽或者分叉的现象。降低甲醇含量，有助于降低溶剂效应。因此，采用增加氮吹浓缩步骤，即取2mL上清液，用氮吹浓缩至1mL后（不足1mL时加入水定容至1mL），过0.22μm水相滤膜于色谱瓶再进样分析。由于在氮吹过程中，部分甲醇得以挥发，溶剂效应降低，MI溶剂效应减小，色谱图干净且无干扰。

2.3 提取时间的选择

以甲醇（1＋1）溶液为提取溶剂，考察了不同提取时间（10，20，30，40，60min）对提取率的影响，结果见图3。

图3 提取时间对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction recovery

由图3可知：提取时间为30min时，提取率达到最大；30min后，随着提取时间的增加，提取率有所减小。试验选择提取时间为30min。

2.4 工作曲线、检出限和测定下限

按试验方法对混合标准溶液系列进行测定，以目标物峰面积（y）对其质量浓度（x）进行线性回归，线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

按3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N）为0.005～0.01mg·L－1，按10倍信噪比计算方法的测定下限（10S／N）为0.015～0.03mg·L－1。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收试验

在样品中分别添加低、中、高等3个水平的标准溶液，按试验方法进行测定，每个添加水平重复测定6次，计算加标回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果（n＝6）Tab.3 Results of tests for precision and recovery

由表3可知：3种异噻唑啉酮类化合物的加标回收率在92.2%～100%之间，RSD在1.2%～6.0%之间，表明方法的准确度和精密度较高。

2.6 样品分析

按试验方法对6种不同类型烟用水基胶中3种异噻唑啉酮类化合物含量进行测定，结果见表4。

表4 样品中3种异噻唑啉酮类化合物的分析结果Tab.4 Analytical results of 3isothiazolinones in samplesμg·g－1

由表4可知：烟用水基胶中3种异噻唑啉酮类化合物都有不同程度的添加，其中MI使用相对于其余两种更多。

本工作通过对样品提取条件、色谱条件的优化，建立了超高效液相色谱法快速测定烟用水基胶中3种异噻唑啉酮类化合物含量的方法。该方法简便、快速、灵敏度高，可适用于水基胶中3种异噻唑啉酮杀菌剂的测定。

［1］ 王向辉，贺永宁，盘茂东，等.异噻唑啉酮类衍生物的合成及应用研究进展［J］.海南大学学报（自然科学版），2008，26（4）：372－377.

［2］ 付忠叶，王庆，贾兰妮，等.异噻唑啉酮衍生物近10年的制备和应用研究进展［J］.材料导报，2012，26（s1）：291－296.

［3］ 邬庆梅.异噻唑啉酮防腐剂——一种化妆品皮炎持续流行的病因［J］.国外医学（卫生学分册），1990（3）：191－192.

［4］ JERSCHOW E，HOSTYNEK J J，MAIBACH H I.Allergic contact dermatitis elicitation thresholds of potent allergens in humans［J］.Food and Chemical Toxicology，2001，39（11）：1095－1108.

［5］ 司新生，杨俊伟，杭磊.日化级异噻唑啉酮类杀菌防腐剂皮肤刺激实验及其机理的研究［J］.应用化工，2011，40（10）：1789－1791.

［6］ EN 71－9－2005 Safety of toys－Organic chemical compounds－Requirements［S］.

［7］ GB 9685－2008 食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准［S］.

［8］ 中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范［S］.

［9］ 张建枚，潘亚男，白桦.UV法测定异噻唑啉酮衍生物活性物含量［J］.工业水处理，2011，31（5）：70－71.

［10］ 王超，张青，王星.化妆品中甲基异噻唑啉酮及其氯代物的高效液相色谱测定法［J］.环境与健康杂志，2007，24（6）：449－450.

［11］ 赵美丽.HPLC法测定化妆品中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物［J］.江西化工，2013（4）：188－195.

［12］ 林芳，毛树禄，陈斌，等.皮革中异噻唑啉酮防霉剂的检测方法［J］.中国皮革，2011，40（7）：5－10.

［13］ 刘奋，戴京晶，梁伟，等.气相色谱法测定化妆品防腐剂凯松［J］.现代预防医学，2004，31（6）：872－873.

［14］ NAKASHIMA H，MATSUNAGA I，MIYANO N，et al.Determination of antimicrobial agents in non－formalin adhesives for wallpaper［J］.Journal of Health Science，2000，46（6）：447－454.

［15］ RAFOTH A，GABRIEL S，SACHER F，et al.Analysis of isothiazolinones in environmental waters by gas chromatography－mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2007，1164（1／2）：74－81.

［16］ LIN Q B，WANG T J，SONG H，et al.Analysis of isothiazolinone biocides in paper for food packaging by ultra－high－performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Food Additives and Contaminants Part A，2010，27（12）：1775－1781.

［17］ BESTER K，LAMANI X.Determination of biocides as well as some biocide metabolites from facade runoff waters by solid phase extraction and high performance liquid chromatographic separation and tandem mass spectrometry detection［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217（32）：5204－5214.

［18］ ALVAREZ－RIVERA G，DAGNAC T，LORES M，et al.Determination of isothiazolinone preservatives in cosmetics and household products by matrix solidphase dispersion followed by high－performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2012，1270：41－50.

［19］ 杨荣静，卫碧文，于文佳，等.液相色谱－串联质谱法检测玩具中的3种异噻唑啉酮类防腐剂［J］.色谱，2011，29（6）：513－516.

［20］ 黄华发，张建平，黄朝章，等.液相色谱串联质谱法测定再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物［J］.中国烟草学报，2015，21（3）：5－11.

［21］ ROSERO－MOREANO M，CANELLAS E，NERIN C.Three－phase hollow－fiber liquid－phase microextraction combined with HPLC－UV for the determination of isothiazolinone biocides in adhesives used for food packaging materials［J］.J Sep Sci，2014，37（3）：272－280.

［22］ 周晓，李小兰，陈志燕，等.高效液相色谱法测定水基胶黏剂中3种异噻唑啉酮类杀菌剂［J］.色谱，2015，33（1）：75－79.

［23］ 卢昕博，肖卫强，许高燕，等.LC－MS／MS法测定水基胶中的3种异噻唑啉酮类防腐剂［J］.中国烟草学报，2015，21（4）：7－13.

UHPLC Determination of 3Isothiazolinone Bactericides in Water－Based Adhesive for Cigarettes

JI Hou－wei，DONG Rui，LIU Jian＊，ZHANG Li，WANG Fang，HUANG Xi－juan，PENG Qian－rong
（Technology Center of China Tobacco Guizhou Industrial Co.，Ltd.，Guiyang550009，China）

UHPLC combined with ultrasonic extraction was applied to the simultaneous determination of 3 isothiazolinones in water－based adhesive for cigarettes.The sample（0.300 0g）was extracted by ultrasonic with 20mL of methanol solution（1＋1）for 30min.The extract was separated on a Waters ACQUITY UPLC HSS T3 chromatographic column with the mixture of water and acetonitrile as mobile phase in gradient elution.Anlytes were detected by diode array detector at the wavelength of 275nm and 318nm.Linear relationships were found between values of peak area and mass concentration of the 3isothiazolinones in definite ranges，with detection limits（3S／N）in the range of 0.005－0.01mg·L－1，and lower limits of determination（10S／N）in the range of 0.015－0.03mg·L－1.Recoveries obtained by standard addition method were in the range of 92.2%－100%and RSDs（n＝6）were in the range of 1.2%－6.0%.

UHPLC；Ultrasonic extraction；Isothiazolinone；Water－based adhesive for cigarett

O657.7

A

1001－4020（2017）04－0432－05

10.11973／lhjy－hx201704013

2016－04－11

贵州中烟工业有限责任公司科技项目（201316）

姬厚伟（1978－），男，河南新乡人，工程师，硕士，主要从事烟用材料及烟草化学分析研究。

＊通信联系人。E－mail：liuj1208＠163.com