超高效液相色谱－串联质谱法测定根痛平胶囊及片剂中松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量

王志嘉，王 璐

（辽宁省分析科学研究院，辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心，辽宁省分析测试技术研究重点实验室，沈阳110015）

超高效液相色谱－串联质谱法测定根痛平胶囊及片剂中松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量

王志嘉，王 璐

（辽宁省分析科学研究院，辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心，辽宁省分析测试技术研究重点实验室，沈阳110015）

样品0.200 0g在乙醇中超声提取30min，再用乙醇稀释至10.0mL。提取液以Zorbax SB－C18色谱柱为固定相，以乙腈－0.1%（体积分数）甲酸溶液（17＋3）混合液为流动相进行色谱分离。质谱分析中采用电喷雾正离子源，多反应监测模式，基质匹配制作标准曲线，外标法定量。结果表明：松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的质量浓度均在10.0～1 000μg·L－1范围内呈线性，检出限（3S／N）分别为0.9，3.1μg·kg－1。按标准加入法在3个浓度水平上进行加标回收试验，测得回收率在95.2%～101%之间，日内、日间精密度（n＝6）均小于9%。

超高效液相色谱－串联质谱法；松香酸；11－羰基－β－乙酰乳香酸；根痛平胶囊及片剂

根痛平胶囊（片）是由红花、没药（醋炙）、乳香（醋炙）、葛根等12味中药制成的复方制剂，具有活血化瘀、舒筋通络、祛风止痛之功效［1］。临床上常用于治疗肥大性脊椎炎、颈椎病、跟骨刺、增生性关节炎和大骨节病等［2－3］。复方中乳香为含二萜、三萜酸类化合物，主要特征成分为11－羰基－β－乙酰乳香酸（图1b），其来源主要依靠进口，价格较贵，市场上常有松香掺假的伪劣品出现［4－6］。松香为松脂蒸馏后的固体剩余物，属于萜类化合物，主要成分松香酸（图1a），有小毒［7］。因此药品中非法添加松香不仅降低药效，还具有一定的安全风险。

图1 松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的结构式Fig.1 Structrual formulae of abietic acid and 11－carbonylβ－acetyl boswellic acid

目前关于松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）［8－10］和薄层色谱法（TLC）［11］等。其中TLC只作为筛查方法，不进行定量分析；HPLC容易受到基质干扰，且检出限很难达到要求。因此，有必要建立一种灵敏、简便、准确，适用于测定中药制剂中松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的方法。

本工作采用超高效液相色谱－串联质谱法（UHPLC－MS／MS）同时测定根痛平胶囊及片剂中松香酸、11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量，对液相色谱和质谱条件进行系统优化，并针对基质效应问题进行初步研究。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200UPLC／6410BMS／MS型液相色谱－串联四极杆质谱联用仪；KQ 3200DB型超声清洗器；Milli－Q型纯水系统。

混合标准储备溶液：0.10g·L－1，称取松香酸、11－羰基－β－乙酰乳香酸标准品各5.0mg，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，于－20℃冰箱中保存。

乙腈、甲酸为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1）色谱条件 Zorbax SB－C18色谱柱（2.1mm×150mm，3.5μm）；流动相为乙腈－0.1%（体积分数，下同）甲酸溶液（17＋3）混合液，流量0.3mL·min－1；柱温30℃；进样量10μL。

2）质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子电离模式；干燥气（氮气）温度350℃，干燥气流量9.0L·min－1；雾化气（氮气）压力285kPa；电喷雾电压4 000V；扫描方式为多反应监测（MRM）模式。

其他质谱参数见表1，其中“＊”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

称取试样（胶囊倾倒内容物，片剂粉碎）0.200 0g于10mL容量瓶中，加入适量乙醇，超声处理30min，放冷，用乙醇定容，摇匀，过0.20μm微孔滤膜，按仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

以乙腈－0.1%甲酸溶液为流动相，采用Zorbax SB－C18色谱柱对样品进行色谱分离，等度洗脱。结果显示：两种化合物在6min内得到有效分离，且色谱峰形对称。0.10mg·L－1松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸混合标准溶液的总离子流色谱图见图2。

2.2 质谱条件的选择

0.10 mg·L－1的松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸混合标准溶液分别在正、负模式下进行一级质谱全扫描。结果显示：两种化合物在正负模式下均可带电，分别形成［M＋H］＋m／z 303，513及［MH］－m／z301，511的准分子离子峰，但在ESI－模式下的信号响应明显低于ESI＋模式。选择ESI＋模式，优化源内碎裂电压，对母离子进行扫描，选取丰度相对较强的2对碎片离子作为定量和定性离子，松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的二级离子质谱图见图3。

图2 松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的总离子流色谱图Fig.2 TIC chromatogram of abietic acid and 11－carbonyl－β－acetyl boswellic acid

图3 松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的二级离子质谱图Fig.3 MS／MS spectra of abietic acid and 11－carbonyl－β－acetyl boswellic acid

2.3 基质效应

基质效应是指基质中的共提取物干扰目标化合物的离子化，导致目标化合物发生离子增强或抑制作用。试验将空白样品处理后通过加标法评估基质效应。取阴性样品（胶囊、片剂）按试验方法处理，得到空白基质溶液，配制成10μg·L－1的松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸混合基质液，与相同质量浓度的混合标准溶液平行进样，重复3次。以二者的峰面积比计算基质效应M（%）＝A0／A1×100%，其中A0为待测物添加在空白基质中的峰面积，A1为待测物添加在标准溶液的峰面积。若M＞1，存在基质增强效应，若M＜1，存在基质抑制效应，若M＝1，无基质效应，结果见图4。

图4 胶囊及片剂样品对松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的基质效应Fig.4 Matrix effects of abietic acid and 11－carbonylβ－acetyl boswellic acid in capsules and tablets

由图4可知：松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸均存在不同程度的基质抑制效应。因此，在实际样品分析过程中采用基质加标法定量以补偿基质效应影响。

2.4 标准曲线与检出限

用甲醇逐级稀释标准储备溶液，配制松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的质量浓度为10.0，20.0，50.0，100，200，500，1 000μg·L－1混合标准溶液系列，以各组分的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其线性参数见表2。

分别以3倍信噪比（3S／N）和10倍信噪比（10S／N）计算方法的检出限和测定下限，结果见表2。

2.5 精密度与回收试验

取阴性样品分别添加松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸混合标准溶液20.0，100，500μg·L－1，每个添加水平测定6次。通过1d内测定3个加标水平下的6个平行样品考查其日内精密度，由连续6d测定3个加标水平的样品考查其日间精密度，加标回收率和相对标准偏差（RSD）见表3。

由表3可知：松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的加标回收率分别在97.8%～101%、95.2%～98.6%之间，日内相对标准偏差分别在2.1%～4.2%、3.8%～5.1%之间，日间相对标准偏差分别在4.9%～7.7%，5.6%～8.9%之间。

表2 线性参数、检出限及测定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表3 精密度和回收试验（n＝6）Tab.3 Results of tests for precision and recovery

2.6 样品分析

按试验方法对市售的30批根痛平胶囊或片剂样品进行分析，30批胶囊或片剂中均检出11－羰基－β－乙酰乳香酸，其质量分数在2.1～15.1mg·g－1之间，其中4批检出松香酸，其质量分数在0.7～5.1mg·g－1之间，其阳性样品的色谱图见图5。结果表明，存在用松香冒充乳香投料的问题，应引起重视。

图5 阳性样品色谱图Fig.5 Chromatogram of positive sample

本工作提出了超高效液相色谱－串联质谱法测定根痛平胶囊或片剂中松香酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量。方法灵敏度高、操作简便，具有很好的实际应用价值，可为中药打假提供有效手段。

［1］ 马育彪，彭镰心，邹亮，等.根痛平胶囊中甘草酸的含量测定［J］.西南民族大学学报（自然科学版），2001，37（4）：625－627.

［2］ 郎然，王晓平，杨朦.根痛平片治疗神经根型颈椎病疗效观察［J］.中医正骨，2006，18（11）：49－49.

［3］ 盘胜枝，罗文正.根痛平颗粒治疗颈椎病的疗效观察［J］.中国实用医药，2007，2（17）：57－57.

［4］ 崔锐，周金云.乳香化学和药理的研究进展［J］.中国药学杂志，2003，38（6）：407－410.

［5］ 钟名诚，饶伟文，肖聪.乳香的商品调查与质量检测方法研究［J］.中国现代应用药学，2012，29（5）：409－414.

［6］ 肖聪，饶伟文，钟名城.没药掺伪品中松香酸的检测方法研究［J］.中药材，2012，35（8）：1237－1241.

［7］ 张亚双，闵春艳.沉香、乳香和没药中非法添加松香酸的研究与讨论［J］.西北药学杂志，2013，28（2）：133－136.

［8］ 张苏珍，耿志明，王道营，等.固相萃取－高效液相色谱法检测肉鸭表皮组织中的松香酸［J］.食品科学，2014，35（4）：82－85.

［9］ 王瑞忠，张玉荣，何轶，等.HPLC法测定冠脉宁片（胶囊）中11－羰基－β－乙酰乳香酸及松香酸检查［J］.中成药，2014，36（11）：2326－2329.

［10］ 王瑞忠，何轶，张聿梅，等.西黄丸中11－羰基－β－乙酰乳香酸含量测定及松香酸检查方法研究［J］.中国药事，2013，27（4）：389－393.

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UHPLC－MS／MS Determination of Abietic Acid and 11－Carbonyl－βacetyl－boswellic Acid in Gentongping Capsules and Tablets

WANG Zhi－jia，WANG Lu
（Liaoning Academy of Analytical Science；Liaoning Research Center of Engineering Technology of
Institution of Standardization Construction；Liaoning Key Laboratory of Analysis and Testing Techniques，Shenyang110015，China）

The sample（0.200 0g）was extracted ultrasonically with ethanol for 30min，and diluted to 10.0mL with ethanol.The extract was separated by UHPLC using Zorbax SB－C18column as stationary phase，and mixture of acetonitrile and 0.1%（φ）formic acid solution（17＋3）as mobile phase.In MS analysis，ESI＋and MRM were adopted.Quantification was attained by external standard method with preparation of standard curves by matrix－matching method.As shown by the results，linear relationships between values of peak area and mass concentration of abietic acid and 11－carbonyl－β－acetyl boswellic acid were found in the same range of 10.0－1 000μg·L－1，and the detection limits（3S／N）found were 0.9，3.1μg·kg－1respectively.Test for recovery was made by standard addition method at 3concentration levels，giving results in the range of 95.2%－101%.Values of the inter－and intra－day precision（RSDs，n＝6）were all less than 9%.

UHPLC－MS／MS；Abietic acid；11－Carbonyl－β－acetyl boswellic acid；Gentongping capsule and tablet

O657.63

A

1001－4020（2017）04－0425－04

10.11973／lhjy－hx201704011

2016－02－02

国家自然科学基金（21307051）；辽宁省自然科学基金（2013020152）

王志嘉（1975－），男，辽宁朝阳人，研究员，从事食品安全管理工作。E－mail：chicago75＠163.com